2021年6月10日，北京朝阳医院唐子人教授团队的最新研究成果《DL‐3‐n‐butylphthalide‐induced neuroprotection in rat models of asphyxia‐induced cardiac arrest followed by cardiopulmonary resuscitation》在线发表于《Cellular Physiology》杂志上（IF=6.384），本研究旨在观察丁苯酞能否减少心脏骤停后大鼠海马神经元的损伤，并探讨其可能的神经保护机制。研究结果表明，NBP 通过抑制 JNK/p38 信号通路介导的细胞凋亡和 NF-κB 介导的炎症发挥神经保护作用，通过 NBP 治疗减轻了海马神经元线粒体的超微结构损伤，此外，发现 NBP 可以减少 CA 后神经毒性因子 PHF-Tau 表达的新证据。
心脏骤停 (CA) 是一种具有高发病率的致死性疾病。只有 23.9% 的成年心脏骤停患者出院后存活，包括海马在内的大脑多个区域的神经损伤可导致出院患者的发病率显著增加。由于心脏骤停患者预后不良，神经功能机制复杂，目前仍缺乏有效药物干预。尽管心脏骤停后脑损伤的初始触发机制与卒中不同，但心脏骤停后脑损伤的病理信号通路和随后的细胞凋亡机制与缺血性卒中相似。既往研究显示，NBP 可以增加海马 CA1 细胞的数量。然而，除了减少神经元凋亡外，NBP 是否还有其它脑保护机制尚不清楚。因此，有必要验证 NBP 对心脏骤停相关损伤的不同保护作用，并阐明其细胞和分子机制。
39 只大鼠随机分为 3 组：假手术组（n=13）、对照组（n=13）和 NBP 组（n=13）。每组使用 8 只大鼠评估神经功能，其余 5 只大鼠在心肺复苏治疗成功后 24 小时实施安乐死进行下一步测试。神经缺陷评分（NDS）用于评估神经系统功能，TUNEL 法评估细胞凋亡水平，透射电子显微镜下观察到海马神经元的超微结构，免疫蛋白印迹检测 p-JNK 或 p-p38 的表达、p65、p-p65、IκBα、 p-IκBα和 TNFα、PHF-Tau 等炎性蛋白表达。
➤ NBP 改善窒息性心脏骤停大鼠神经功能障碍
本研究通过神经缺陷评分，评估了 NBP 是否可以改善窒息模型中的神经功能障碍。如下表所示，与对照组比较，NBP 治疗 24、48、72h 后窒息性心脏骤停模型评分从 218±26 降至 172±20、186±28降至136±19、165±35降至100±27。
➤ NBP 抑制心脏骤停大鼠海马区的细胞凋亡
本研究检测了 NBP 是否会影响窒息心脏骤停模型大鼠海马中的神经元凋亡。TUNEL 测定表明，与假手术大鼠相比，心脏骤停模型海马 CA1 区 TUNEL 阳性细胞的比例急剧增加（图 1a、b、d）。NBP 治疗后，与对照组大鼠相比 NBP 组 TUNEL 阳性细胞的比例显著降低（图 1b-d）。此外，窒息诱导心脏骤停模型大鼠海马区活性 Caspase-3 蛋白水平显著升高，表明心肺复苏后大鼠神经元凋亡是通过 Caspase 3 依赖性途径介导的。相比之下，在用 NBP 治疗后的大鼠中观察到活性 Caspase-3 水平显著降低（图2a,b），而 Caspase-3 的蛋白质水平在不同组中没有明显差异（图2a,c)。阐明了 NBP 在自主循环恢复 (ROSC) 后心脏骤停模型海马中的抗凋亡作用机制。对照组 p-JNK 或 p-p38 的表达水平显著高于假手术组，表明海马区 JNK/p38 信号传导的激活（图3a-c）。相比之下，NBP 治疗的心脏骤停模型海马中 p-JNK 和 p-p38 水平均降低，表明 NBP 介导了 JNK/p38 信号传导的抗凋亡作用（图3a-c，对于 P-JNK，P-p38）。然而，作为内部对照，研究没有观察到 JNK 或 p38 水平的任何差异（图3a、d、e）。这些数据证明了 NBP 对窒息诱导的心脏骤停模型海马区神经元凋亡的抑制作用。
➤ NBP 减轻海马神经元线粒体超微结构损伤
本研究评估了 NBP 是否可以减轻窒息心脏骤停大鼠海马神经元的超微结构损伤。假手术组海马神经元线粒体超微结构正常，线粒体形态完整，线粒体脊排列明显（图4a）。相反，在窒息心脏骤停组中大鼠的海马神经元中观察到线粒体严重肿胀，并且线粒体脊显示出明显的紊乱（图4b）。同时，大鼠细胞质中观察到自噬体，表明神经元发生了严重的损伤和凋亡。NBP治疗后，心脏骤停模型大鼠线粒体肿胀得到缓解，细胞质中自噬体的数量减少（图4c）。因此，NBP 治疗可以减轻窒息诱导的心脏骤停模型海马神经元线粒体超微结构损伤。
在蛋白印迹分析中，与假手术组大鼠相比，心脏骤停后 72 小时脑损伤周围区域的 NF-κB、p65 的水平显著增加。NBP 处理显著降低了心脏骤停诱导的 NF-κB、p65 增加（图 5a）。研究还发现对照组中 p65 和 p-p65 水平明显增加，而 NBP 治疗显著降低了它们的表达（图 5a-c）。此外，通过蛋白印迹分析检测 IκBα 蛋白的水平及 p-IκBα 与总 IκBα 的比率（图 5a）。结果显示对照组大鼠中该比率显著高于假手术组大鼠，NBP 组治疗显著降低 p-IκBα/总 IκBα 比率（图 5d）。研究评估了 NBP 对炎症介质表达的影响。Western 印迹分析显示 NBP 处理后可以降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达的增加（图5e）。
➤ NBP 抑制了心脏骤停模型中海马区域的神经毒性
微管相关蛋白 tau (MAPT)，构成神经元内神经原纤维，通常在神经退行性疾病中观察到，这种蛋白可能是神经毒性和神经功能障碍的标志物。研究团队发现与假手术组相比，对照组中 PHF-Tau 的表达水平急剧增加（图6a，b），通过 NBP 处理，PHF-Tau 水平比未处理的对照组大鼠蛋白水平显著降低（图6a，b）。因此，心脏骤停模型中神经元异常和神经毒性增强，而使用 NBP 治疗可减轻海马区的病变。
本研究发现 NBP 在心脏骤停后有多种治疗益处。NBP 治疗可以减少神经元以及线粒体超微结构损伤，通过 JNK/p38 途径减少细胞凋亡，通过 NF-κB 途径减轻炎症反应，以及通过降低 PHF-Tau 水平降低神经毒性。研究显示应用 NBP 可以减少心脏骤停大鼠海马神经元的损伤和调亡，改善神经系统预后，这表明 NBP 可以作为预防心脏骤停脑损伤的治疗药物。参考文献：Yang Song,Yu Changxiao,Yang Zhengfei et al.DL-3-n-butylphthalide-induced neuroprotection in rat models of asphyxia-inducedcardiac arrest followed by cardiopulmonary resuscitation.[J] .J Cell Physiol,2021, undefined: undefined.