SVN:丁苯酞减少伴静脉引流障碍的皮层梗死的脑损伤
近日，来自暨南大学附属第一医院神经内科黄立安教授研究团队的最新研究成果《Dl-3-n-butylphthalide attenuates brain injury caused by cortical infarction accompanied by cranial venous drainage disturbance》在《Stroke & Vascular Neurology》杂志发表（IF: 4.081），本研究旨在探讨静脉引流障碍对脑梗死造成不良反应的可能机制，并探讨丁苯酞对伴有静脉引流障碍的脑梗死的保护作用。研究结果证明：双侧颈外静脉闭塞对正常大鼠不造成严重影响，但会加剧大脑中动脉闭塞（MCAO）型大鼠的脑损伤。丁苯酞治疗主要是通过促进脑血流恢复和保护血脑屏障对伴有静脉引流障碍的MCAO大鼠起到神经保护作用。
静脉系统是血液循环的流出通道和血液储备器官，对调节颅内压、维持血脑屏障 （BBB）的完整性具有重要作用。同时，静脉血在血液储存中扮演重要作用，其中脑血容量的70-80%储存于静脉系统中。静脉系统在维持中枢神经系统正常功能中发挥重要作用，既往研究提示，自发性颅内压增高与完全或部分的颈内静脉闭塞相关。脑静脉异常可导致一系列中枢神经系统疾病，如脑水肿、高颅压头痛、短暂性单眼失明、癫痫以及皮质发育异常等。有证据表明，静脉引流障碍可加重缺血性卒中，如闭塞MCAO大鼠的双侧颈外静脉将显著增加梗死体积。在临床上，皮质静脉充盈缓慢及充盈范围差与预后不良相关，动态CT血管造影（dCTA）静脉相晚期皮质静脉充盈延迟被认为是急性缺血性卒中（AIS）患者溶栓治疗后再灌注不良的标志。同侧静脉引流障碍的AIS患者更容易发生早期致命性水肿。然而，静脉循环缺陷引起的缺血性卒中不良反应的机制尚不清楚，也没有关于伴有静脉引流障碍的AIS的针对性治疗的报道。
丁苯酞是一种用于治疗缺血性卒中的小分子多靶点药物，具有恢复脑动脉管径、促进血管生成、促进轴突生长和神经发生等多种作用。但丁苯酞是否对伴有静脉循环障碍的AIS患者具有相同的神经保护作用目前尚不清楚。现实世界中，超过20%的人存在静脉结构异常，因此伴有脑静脉障碍的缺血性卒中的潜在治疗方法值得进一步探索。
通过永久性闭塞SD大鼠的双侧颈外静脉制备脑静脉引流障碍（EJVO）模型，并通过永久性闭塞其右侧大脑中动脉（MCAO）模拟缺血性卒中模型。将310只成年雄性Sprague-Dawley大鼠（周龄8，300-380g）分为假手术（Sham）组、颈外静脉闭塞（EJVO）组、MCAO组、颈外静脉闭塞+大脑中动脉闭塞（EJVO+MCAO）组，和颈外静脉闭塞+大脑中动脉闭塞+丁苯酞治疗（EJVO+MCAO+NBP）组，共5组。分别通过TTC染色、磁共振、伊文斯兰外渗及行为学试验评估梗死体积、脑血流量（cerebral blood flow，CBF）、血脑屏障完整性和神经功能。通过免疫荧光染色和western blot（WB）评估神经元、内皮细胞、周细胞和紧密连接的丢失程度。
（一）NBP可减少静脉循环障碍引起的梗死体积增加
为探讨双侧颈外静脉阻塞是否会增加梗死体积，研究选择MCAO术后24和72小时两个时间点进TTC染色测量梗死体积。结果显示在两个时间点，伴有静脉循环障碍的MCAO大鼠梗死体积均较单纯MCAO组大鼠明显增大。在伴有静脉循环障碍的MCAO大鼠中，NBP治疗3天可减少梗死面积（图1）。
图1
（二）NBP可减轻由静脉循环障碍加剧的神经功能恶化
为了评估MCAO后的神经损伤和NBP的治疗效果，并评估脑静脉引流障碍是否会对大鼠的神经功能产生影响，研究动态观察了每只动物的运动和感觉功能。双侧颈外静脉闭塞对正常大鼠的神经行为学评分无显著影响，但对皮层梗死的大鼠的神经行为学评分有显著影响。与假手术组大鼠相比，伴有或不伴有静脉循环障碍的MCAO大都存在明显的神经损伤，且伴有静脉循环障碍的皮质梗死大鼠展现出更严重的神经损伤，主要表现为前肢抓力更差（图2a），平衡木实验评分更高（图2b），除胶时间更长（图2c）。与安慰剂对照组相比，接受NBP治疗的大鼠神经功能更好（图2a-c）。
图2
（三）NBP减少MCAO和EJVO后神经元损伤
通过HE染色观察神经元形态，如（图3a）所示。随着病情的进展，核膜破裂，细胞质与细胞核内容物混合，提示神经细胞受损。与假手术组相比，接受MCAO手术的大鼠表现出更明显的神经元损伤。EJVO+MCAO组神经元损伤更早发生，且损伤更为严重。在EJVO+MCAO大鼠中，NBP治疗组的神经元损伤较未治疗组程度更轻，核破裂发生更晚。
尼氏染色观察神经元内的尼氏小体。如（图3b）所示，假手术组和EJVO组的大鼠尼氏小体几乎不受影响，而在MCAO、EJVO+MCAO和EJVO+MCAO+NBP组中，尼氏染色显示神经元排列紊乱，早期即出现大量暗神经元，尼氏染色阳性的细胞数明显低于假手术组。与EJVO+MCAO组相比，MCAO组和EJVO+MCAO+NBP组的尼氏染色阳性细胞数更多，这表明EJVO加重了MCAO组大鼠的神经元损伤，而NBP处理保护了部分神经元。
为了分析梗死区存活的神经元细胞，研究利用NeuN的特异性免疫荧光染色标记神经元。（图3c）为皮层梗死区域的神经元。EJVO手术后大鼠的神经元与假手术组无明显差异。MCAO导致神经细胞显著丢失，EJVO+MCAO组大鼠的神经细胞丢失程度较MCAO组大鼠更严重，从术后第3天开始差异具有统计学意义。在伴有静脉循环的MCAO大鼠中，与安慰剂组相比，NBP治疗组的损伤更轻（图3d）。通过westernblotting验证NeuN蛋白浓度与免疫荧光一致（图3e-h）。这些发现表明，一旦发生脑梗死，静脉循环障碍的存在会加重神经元损伤。然而，NBP对伴有静脉障碍的MCAO大鼠有保护作用。
图3
（四）NBP促进伴有静脉循环障碍的MCAO大鼠微血管生成
为了探讨静脉循环障碍对脑梗死后血管生成的影响，研究通过免疫荧光法测定脑组织切片中CD31的覆盖率，并通过western blot方法评估缺血脑组织中CD31的总浓度。结果显示，EJVO组CD31水平略有下降，但差异无统计学意义（图4）。无论是否伴有静脉循环障碍，MCAO后第1天CD31显著减少。在术后第3天，单纯MCAO组CD31明显改善，恢复至正常水平；然而，EJVO+MCAO组显示CD31仅有轻度增加。EJVO+MCAO组与假手术组、EJVO组和MCAO组之间仍存在显著的统计学差异。在术后第7天，EJVO+MCAO组CD31恢复至正常水平，但仍明显低于单纯MCAO组。在术后第14天，MCAO组的CD31水平显著高于假手术组，而EJVO+MCAO组的CD31水平有所升高，但无统计学差异。在伴有静脉循环障碍的MCAO大鼠中，NBP治疗可以显著增加血管内皮密度。作为体内的第三级侧支循环，血管新生是脑血流的恢复重要助力。本研究结果表明，双侧颈外静脉闭塞导致的静脉循环障碍会阻碍梗死区的新生血管形成，而NBP治疗可促进这些大鼠的血管新生。
图4
（五）NBP可降低结扎静脉远端压力升高的程度
如（图5）所示，在8个时间点进行了颈外静脉压力的测量，即术前、术后即刻、2小时、6小时、12小时、1天、3天和7天。结扎双侧颈外静脉可导致颈外静脉压力立即升高，升高的颈外静脉压在术后2小时开始下降，在术后第3天已恢复至正常水平。单纯MCAO手术不会导致颈外静脉压力增加。与EJVO组相似，在EJVO+MCAO和EJVO+MCAO+NBP组中，研究发现术后即刻颈外静脉压力显著升高。在EJVO+MCAO组中，升高的颈外静脉压力至少持续3天，而在NBP治疗组中，这种状态仅持续不到1天。NBP治疗有助于EJVO+MCAO大鼠的静脉循环的恢复，降低颈外静脉压力。
图5
（六）NBP促进静脉循环障碍大鼠MCAO后CBF的恢复
在本研究中，3D ASL用于大鼠CBF的动态评估。在5个时间点对梗死的皮质区（或非MCAO大鼠的相应脑区）进行CBF值的测量，即术前、术后即刻以及术后第3天、7天和14天。在EJVO组大鼠中，术后即刻出现了短暂的CBF下降，下降的CBF值在第3天恢复正常。MCAO组大鼠的CBF显著下降，但EJVO+MCAO组下降更为严重。与EJVO+MCAO组相比，NBP治疗组大鼠的CBF恢复更快。结果表明，MCAO大鼠脑血流量显著下降，EJVO延缓了MCAO大鼠脑血流量的恢复。NBP治疗可加速EJVO+MCAO大鼠的CBF恢复。CBF图和相对值的定量分析如（图6a和b）所示。
图6
（七）NBP可减轻静脉循环障碍引起的BBB损伤
研究通过测定EB外渗来评估BBB的完整性。EB在体内循环3小时后，将大脑切片用于拍照和测量吸光度，如（图7a）所示。双侧颈外静脉闭塞不会导致明显的EB外渗，而在MCAO后，EJVO在很大程度上加重了BBB损伤（图7b）。单纯MCAO大鼠的EB外渗在术后14天恢复至正常，但EJVO+MCAO组大鼠的EB外渗在整个研究期间均保持在较高水平。NBP治疗减轻了伴静脉循环障碍的MCAO大鼠的EB外渗（图7a和b）。课题组通过测量脑含水量评估脑水肿程度。如（图7c），EJVO组大鼠的脑含水量在术后第1天短暂升高，并迅速恢复至正常，提示急性脑静脉循环障碍可能导致短暂的脑水肿。此外，与假手术组相比，MCAO组大鼠的在术后第1天至第7天存在脑水肿。在伴有静脉循环障碍的MCAO组中大鼠的脑水肿程度比单纯MCAO大鼠更为严重，这提示静脉循环障碍对脑水肿产生不利影响。此外，当单纯MCAO大鼠的脑含水量在术后第14天恢复到正常水平时，EJVO+MCAO组的脑含水量明显高于假手术组。NBP治疗3天后可减轻伴有静脉循环障碍的MCAO大鼠的脑水肿程度。
图7
（八）NBP降低了MCAO和EJVO对BBB完整性的破坏
周细胞是包饶内皮细胞的一种细胞，是血脑屏障的重要组成部分。周细胞也分布于小静脉和小动脉，具有收缩和迁移的能力。为了探讨本研究中周细胞的变化，研究选择用PDGFRβ和Desmin双重标记周细胞。无论是否存在静脉循环障碍，接受MCAO手术的大鼠在术后1天均出现周细胞减少。术后第1天，EJVO+MCAO大鼠的PDGFRβ和Desmin水平显著低于MCAO大鼠。术后第3天，MCAO组周细胞显著增多，远高于正常水平，而EJVO+MCAO组术后第3天PDGFRβ和Desmin均升高至正常水平，且明显低于MCAO组。所有接受MCAO手术的大鼠（伴或不伴EJVO）在7天后缺血区周细胞数量均增加，而单纯MCAO组大鼠的增加更为显著。NBP治疗可以在早期减少周细胞的丢失，并在后续过程中更大程度上增加PDGFRβ和Desmin水平（图8）。
图8
此外，包括ZO-1和Occluding在内的紧密连接蛋白在MCAO术后显著降低；而单纯EJVO组大鼠的紧密连接蛋白在整个研究期间没有明显变化。通过评估伴或不伴静脉引流障碍的MCAO大鼠的ZO-1水平，研究发现伴或不伴EJVO的MCAO两组大鼠的ZO-1水平在术后第7天开始有显著差异。在术后14天时，单纯MCAO组ZO-1恢复至正常水平，而EJVO+MCAO组仍低于正常。NBP治疗可以明显提高EJVO+MCAO大鼠的ZO-1水平，尤其是在治疗7天后（图9）。Occludin的下降同样见于MCAO术后，且在EJVO+MCAO下降程度更为严重。NBP治疗3天后Occludin水平明显升高（图9）。上述研究结果提示，脑静脉引流障碍将加剧MCAO后的BBB损伤，NBP治疗对伴有静脉引流障碍的MCAO大鼠的BBB具有保护作用。
图9
综上所述，本研究结果表明闭塞双侧颈外静脉对正常大鼠没有显著影响，但在大脑中动脉闭塞的情况下，闭塞双侧颈外静脉会加重脑损伤。NBP可以通过促进脑血流恢复和保护血脑屏障对伴有静脉引流障碍的MCAO大鼠起到神经保护作用，本研究是NBP对改善静脉回流障碍卒中的首次探索，为未来开展相关临床提供了理论依据。