你的高效液相色谱柱“任性”吗？
色谱柱是高效液相色谱的核心部件。它主要起到了分离作用。色谱柱同样也是一个消耗品，在流动相冲刷的过程和样品在分析的过程，填料损失和污染使得色谱柱的性能慢慢下降。所以，对于高效液相色谱尤其是常用的C18柱，需要在一定时间内对其性能做一个评估，同样，新的色谱柱也要对色谱柱做一个有效的体检。这个体检就是评估色谱柱的性能。
在讲评估色谱柱性能之前，青青草老师讲一段自己的经历。
曾经在07年我在一家仪器公司从事装色谱柱工作，是商品柱哦。主要是3微米，5微米，10微米C18分析柱子，其中前两个颗粒大小的色谱柱是分析型色谱柱。反相色谱柱最一般的规格型号是 4.6mm内径，150mm，250mm长度，颗粒度一般有3微米，5微米，其中5微米比较多。当然还有其他规格长度的色谱柱，这里就不再展开讲述了。色谱柱主要是两端封有筛板柱头，中间的空心不锈钢管子中装有填料。这些填料主要作用就是吸附样品，同样，在流动相推动下，混合样品中各物质由于结构性质不同，从而使得他们被吸附脱附的能力不同，被分离。
高效液相色谱柱，尤其是C18的反相色谱柱是通过高压匀浆的方法装填的。
通过匀浆液使得色谱填料均匀悬浮在匀浆管中，匀浆管下面装有一根空的色谱管，这根色谱管底部用柱头和筛板固定，通过泵的瞬间高压，流动相将色谱填料填压入色谱管，稳定片刻后，另一头装上筛板和柱头，即可。由于装填色谱柱受到很多的因素影响，所以，不是每一根色谱柱都是能够装填好的，所以，新的色谱柱要通过测试其性能，其性能符合要求，才能够销售。
而我们客户呢，对于购置的新色谱柱，首先需要测试其性能，包括有效塔板数，拖尾因子。这个是最重要的指标。如果这些指标符合要求，那么这根色谱柱是OK的。大家知道，有些小公司没有HPLC，他们销售的色谱柱有可能是不好的，所以，对新色谱柱建立性能档案是很有必要。如果不合格的新色谱柱，立即向供应商调换，才能够保证你的权益。
这里qingqingcao老师给出两个基本的公式。有效塔板数，拖尾因子。
1.有效板数塔
在我们学习色谱理论时候，我们讲过理论塔板数，有效塔板数。这里我不再讲述公式如何来的。我们这里打个比方，现在我手头有两个同样长度，同样内径，同样填料,填料的颗粒度相同的C18色谱柱,一根装的紧，一根装的松，那么大家认为你会选哪根？答案是必然的，当然首选紧的那根。原因是装的紧的那根色谱柱，单位体积内填料多，填料多那么分离效果就好，而松的那根，单位体积填料少，那么分离效果就显得差。那么如何判断相同规格型号长度的色谱柱填料填的多寡，那么就需要用到有效塔板数了。也就是说，通过相同条件下测试同一物质，有效塔板数多的那根色谱性能高，填料填的多，反之就是不好的那根。
我们首先给出公式：
其中，to是死时间，也就是物质不被保留，在色谱系统中走过的时间。一般可以认为进样冲击是死时间。或者剪一根和色谱柱相同长度的空管，装在色谱柱位置，以纯水为流动相，相同流速，进甲醇，以254nm为检测波长，出来峰的那个时间一般认为是死时间。这个方法确实比较粗糙，但是管用。
我们看下公式，相同浓度同一物质，相同色谱条件下，如果半峰宽一致的情况下，某物质被保留的时间越长，则有效塔板数越多。试想，色谱柱越长，填料相同内径相同，装填效果相同的条件下，长的色谱柱必定性能好。
同样，色谱样品条件相同的情况下，半峰宽越窄，色谱柱越好。也就是说，填料装的越紧越好。
其中tm-t0 是调整保留时间。W1/2h是半峰宽。
对于C18柱测试有效塔板数，我们规定使用5mg/ml萘，作为测试品，以甲醇：纯水=70：30（v/v），检测波长为254nm，流速1.0ml/min。有了这些条件，我们再测试下死时间（上述空管+甲醇测死时间），我们就可以计算有效塔板数了。
对于W1/2h如何测试，一般的色谱工作站都会给出每个色谱峰的半峰宽，我们找抄即可。
这里给出一个例题,测试色谱柱的有效塔板数（N eff）
用测试萘的色谱条件测试色谱柱的有效塔板数，有四根色谱柱，
我们可以看到，同样长度的色谱柱，颗粒度越小，其有效塔板数越多。这个如何理解呢？颗粒度越小，那么填料在单位体积内的数量越多，保留效率越高，所以，保留时间比颗粒度小的同样规格的色谱柱要长，这也说明，如果长度，填料内径相同的条件下，其分离效果越高。
相同填料粒径和内径的色谱柱，如果长度越长，填料一般来说越多，保留时间长证明了其保留能力强，这样体现在色谱柱有效塔板数比相同规格的略短的色谱柱多。
有时候使用相同的色谱柱，在用了一段时间后，相同浓度的相同条件下，色谱峰变宽，微观角度来解释，就是色谱柱填料流失。使得色谱柱中填料数目减少，使得色谱柱颗粒间间隙宽。物质在色谱柱里走的路径多了，所以色谱柱展宽。这样子就证明色谱柱性能下降。如果色谱柱性能降到不能有效分离物质，那么这根色谱柱寿终正寝了。
对于C18柱，一般是用甲苯，联苯，萘等物质配成混合物，以5mg/ml萘计算有效塔板数。色谱柱一般需要3个月或半年测定一次有效塔板数。现在色谱工作站有计算有效塔板数的功能，一般我们只要填入t0死时间，就可以计算色谱柱的有效塔板数了。在15年前或者更在，色谱工作者们是通过三角尺和色谱图量的方法计算有效塔板数的。当时确实条件艰苦，但是这样操作，能够实时看到色谱柱使用过程中“牺牲”自我的一个历程。
2. 拖尾因子（tailing factor）
对于拖尾因子，根据中国药典，拖尾因子是指：
从图中，我们可以看到，W0.05h指5%峰高处的峰宽，以峰顶点做垂线到5%峰宽，分为两份，其中前一份为d1，假如前半峰d1=后半峰，则 拖尾因子为1.00.也就是前后半峰5%处宽度相等，说明峰对称 。如果前半峰d1小于后半峰，则Tailing factor 大于1，则峰后拖尾，反之是前拖。
如果排除溶剂因素和物质吸附或键合相尾部效应等因素，单纯从色谱柱填充效果来看，如果色谱柱前面填的紧密，后面填的疏松，即便有效塔板数合格，那么峰显示处后拖尾；如果色谱柱前面填得疏松，后面紧密，则峰显示前拖。所以，中国药典要求色谱柱拖尾因子要在【0.95，1.05】之间。
有许多朋友会讲，还有对称因子。因为在我国一般用拖尾因子即可，对称因子及10%峰高处峰宽比较对称性，只是不同国家定义不同要求不同而已，具体可以参考一些书籍，这里不展开叙述了。在色谱工作站，也有拖尾因子计算，我们选择5%处峰高处计算即可。
对于色谱柱需要给它做一个有效的体检卡，一般在体检卡上检测 有效塔板数和拖尾因子即可，相关的方法，即上述叙述。
对于C18色谱柱清洗，一般的步骤是：洗去缓冲盐用不含盐的流动相冲洗，把缓冲盐洗涤干净，一般是20倍柱体积，也就是0.8-1.0ml/min洗涤各1.5-2小时，然后用乙腈或甲醇洗涤，20倍柱体积，也就是0.8-1.0ml/min洗涤2小时。两端用螺母封柱。一般我比较喜欢用乙腈保存。虽然乙腈毒性是大，但是，乙腈粘度小。
如果色谱柱真的不能用，我们还可以卸下柱前端的柱头，把筛板用异丙醇超声波超洗，挖去前段被污染的色谱填料，补上新的色谱填料，这样，色谱柱暂时还可以用一段时间。
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1.高效液相色谱柱的维护：
我们在使用新的色谱柱应该在我们自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。而且在使用的过程中常常有堵塞的现象，造成这种现象的主要原因是
①溶剂中的不溶物②样品中的不溶物③泵进样器等中的不溶物④柱内不溶物的形成等。
如果当色谱柱堵塞以后我们可以对色谱柱进行修复，首先，使用含盐缓冲液后(如离子对试剂)应用溶解性强的溶剂(如水)进行冲洗。其次，先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗，对于反相色谱柱，可使用、乙睛、四氢呋喃、氯仿、庚烷等，在此条件下，应避免溶剂的pH低于2或高于8。最后如果经过上述还是没有修复，色谱柱压力还是没有下降，则要断开检测器，将色谱柱反方向放置，然后检查柱压，若压力稳定下降，则保持色谱柱反方向连接，用低于0.5ml/min流速冲洗一小时。如果压力不下降，则要看内置过滤器是否被堵塞，如果被堵塞应冲洗或更换，若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。而且修复的厚度是2-5mm
2.高效液相色谱柱的保养：
在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。我们在对色谱柱使用前进行测试以后，我们要根据不同的情况对色谱柱进行保养：①反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。②长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温.
3高效液相色谱柱的维护与保养在液相色谱仪中的应用：
高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的分离分析技术，是现代分离测定的重要手段。问世以来，因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析。是消耗品，会随使用时间或进样的次数增加，出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰，柱效下降。需要定期进行彻底清洗和再生，不同的色谱柱清洗方法各不相同比如：
3.1反相柱分别用甲醇:水=90:10，纯甲醇(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积.然后再以相反的次序冲洗。
3.2正相柱分别用正己烷(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)，甲醇(HPLC级)等溶剂做流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高).注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷，所有的流动相必须严格脱水。
3.3离子交换柱长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降，用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。
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