学习说| 浅谈条件恐惧中学习记忆、焦虑、抑郁

条件恐惧是基于巴普洛夫条件反射而建立的，它测定动物学习、记忆不悦经历(aversiveexperience)和环境之间关联的能力。常用声音或光暗示行为条件刺激(conditioningstiulus, CS)，以厌恶刺激（如足电击）作为非条件刺激(unconditioningstiulus, US)，二者配对出现，经过这种CS-US训练，动物不仅学会声音和电击之间存在联系，而且知道电击和周围环境之间也存在某种联系(context)。前者为听觉暗示条件恐惧(auditorycue fear condidtioning)或暗示条件恐惧(cuedfearcontioning)，后者为关联条件恐惧(contextual fearconditoning)。恐惧是非灵长类动物少有的几种情感反应之一。动物经历条件恐惧后，再次接触条件刺激时，会产生一系列的生理反应，包括自主神经紧张、应激激素分泌增加以及防御行为增多等等，凝滞(freezing)即是动物防御行为的一种，是指动物除呼吸之外没有任何其他活动，犹如在黑夜处于迎面而来的汽车强灯照射之下的惊鹿，一动不动。它被认为是评价啮齿类动物恐惧的可靠指标。

条件恐惧的原理

参与条件关联学习过程的脑部结构主要为杏仁核和海马。前者调节恐惧，后者调节与恐惧性事物相关联的学习认知。所以，这一模型主要用于杏仁核和海马依赖的记忆。动物不需要禁水或禁食，且训练时间相对较短。因此该模型广泛用于转基因小鼠敲除小鼠的行为表型研究。如啮齿类动物在恐惧时会表现出特有的不动状态（immobility）,动物在这种情况下倾向于保持静止不动的防御姿势。抗抑郁药和抗中枢兴奋药可以明显缩短不动状态的持续时间，所以常常用于焦虑、抑郁领域研究，也可以用于恐惧消退等的研究。

条件恐惧实验系统主要组成：

包括条件操作箱、隔音箱和关联条件箱

条件操作箱包括与箱底格栅相联的电击发生器（可产生0-2mA的各种强度的电击）、声音发生器（可产生宽频的卡嗒声或低频音），并与计算机相联。隔音箱装有一灯、一小风扇（用于通风和产生背景音）以及一个与声音发生器相联的扩音器。隔音箱上有一猫眼，用于观察操作箱内的动物。关联箱由透明有机玻璃制成，有可移动的格栅式地板和纱窗式顶部。为防止动物滑至格栅下面，格栅条之间距离应足够短。对小鼠和年幼大鼠，关联条件箱通常为25cm* 25cm* 25cm;格栅地板由不透明钢条（直径1.5cm，中央间距为6mm）组成。对大鼠，关联箱通常为25cm* 25cm* 15cm;格栅地板包括16根不锈钢条（直径为2.5cm、中央间距为10mm）。此外，还有电压计和声强计，用来检测刺激强度。

Panlab特有的震惊与条件恐惧联合测试系统将震惊实验和条件恐惧实验放到一个实验箱体中完成，搭配不同的配件，即可执行震惊或条件恐惧测试，这样的设计不仅节约了用户宝贵的实验空间，也大大的节约了采购成本。

实验箱体采用独特的重力传感器来监测动物的行为，具有很高的灵敏度，可准备地觉察到动物的微小动作，即使小鼠的轻微动作也可识别，从而判断动物的活动/僵立（Freezing）以及震惊反应，动物的任何反应经过特有的放大器后传输到计算机，使用统一设计的PACKWIN软件对数据进行实时的采集和分析，PACKWIN软件可以灵活搭配STARTLE和FREEZING实验模块，分别应用于震惊和条件恐惧实验。同时，系统还可以搭配多种硬件刺激模块，包括灯光、声音、电刺激、吹气，这些硬件均可以通过软件编程进行控制。

注：常常有实验将条件恐惧与震惊结合来看，他们之间有什么区别呢？

1.涉及的脑区不同，研究条件恐惧的主要脑区为杏仁核及其亚区，研究震惊的主要脑区为前额叶及其亚区；

2.实验不一样，“条件恐惧”是条件刺激引起的反应，是条件刺激与非条件刺激的结合；“惊跳反射”是突然的、强烈刺激引起的反应，属于非条件反射；

3.动物受刺激后的表现不一样，“条件恐惧”表现为不动的防御姿势，“惊跳反射”表现为头部、尾巴的运动，进而肌群收缩和舒张；

4.研究的侧重点不一样，“条件恐惧”侧重于抑郁；“惊跳反射”侧重于焦虑；

5.测量指标不一样，“条件恐惧”主要测量与Freezing状态相关的指标，”惊跳反射“主要测量与Startle状态相关的指标。

实验方法

（一）  训练阶段（Day 1）

1.调试仪器，以确保格栅地板有电流刺激、扩音器有声音刺激，并分别记录电流强度和声音强度（分贝）。

2.将大鼠放入条件恐惧箱2min（A相），记录这最初2min内动物的凝滞（frerzing）时间作基线。

3.接着加入咔嗒声，80db，30s（B相）

4.紧接着再给予电击，0.35mA，2s（C相），完成一轮训练。如需要多轮训练，则重复A、B、C三相训练即可。

5.记录整个训练阶段动物凝滞时间（s），用以测量动物的非条件恐惧。

将大鼠移开操作箱。用70%的酒精和4%醋酸溶液彻底清洁操作箱，以备进行下一批动物的训练。

（一）  测试阶段

在训练后的第二天进行，包括关联测试、变更关联或条件刺激前测试以及条件刺激测试。测试阶段没有点击刺激。关联测试和变更关联测试中也没有听觉条件刺激，但每只动物所用的操作箱应与训练阶段的相同。

1、关联测试将动物放入箱内，计算机自动记录动物的凝滞行为。若用人工观察，则观察者用静声秒表通过箱门上的猫眼观察动物的行为并计分：凝滞为1分，活动为0分。每10秒观察一次，共5min，这样可记录到30次可能得凝滞。用这一阶段记录到的、动物在同一操作箱内的凝滞时间测量动物的关联条件恐惧。此为关联测试。观察结束后将动物放回笼内，清洁操作箱，进行下一只动物的观察。

2、变更关联测试和听觉条件刺激测试（关联测试1h后进行）操作如下：

（1）将计算机调至所需程序。

（2）操作箱进行如下改造：1用平滑塑料板取代关联条件箱内的格栅地板；2在箱的对角线加一块有色塑料板，这样将长方体操作箱变为三角体；3改变嗅觉暗示。如可在箱的一角放一个装有一滴桔子汁或柠檬汁的杯子，或将一滴果汁涂于墙上。然后开始变更关联和听觉条件刺激实验。

（3）将动物放入经改造后的关联箱

（4）启动预置的实验程序，每隔10秒记录动物的凝滞和非凝滞得分，共3min，即18次可能的凝滞记录

（5）加入听觉条件刺激30秒。重复上述记录3分钟。

（6）将动物放回笼子，清洁操作箱，进行下一只动物的测试。

（二）结果结算与分析

因为不同类型的学习凝滞时间不同，所以最常使用百分计：

关联=（关联测试中的凝滞得分/30）*100%

变更关联=（变更测试中的凝滞得分/18）*100%

听觉暗示=（听觉条件刺激中凝滞得分/18）*100%

对每一不同的凝滞测试计分进行重复测量单因素方差分析（ANOVA），从此比较关联和变更关联或听觉暗示之间的条件恐惧程度，并确定组间差异。

一般而言，动物在听觉暗示中的凝滞行为要比关联测试的多。在变更关联测试中，由于关联条件箱已被改造得“面目全非”，训练时动物获得的对周围环境的关联几乎不存在，因此凝滞行为应该最少。关联与变更关联差别很大，凝滞计分差别越大。

如果动物在第二天的关联测试和听觉暗示测试中出现凝滞，人在变更关联测试转给你不表现凝滞行为，则可认定：动物的感觉和运动功能均正常；能记住前一天与厌恶刺激配对出现的暗示信号；能分辨前一天不与厌恶刺激配对出现的暗示信号，说明动物具有正常的记忆。这些测试中的任何一项增强或减弱，提示调节记忆情感部分的神经解剖、神经递质和基因可能发生变化。

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