HPLC使用注意事项及柱子使用经验之谈
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography/HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。
HPLC使用注意事项
1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45μm或更细的膜过滤)。
2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。
3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20mL以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如，甲醇等），因为纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗，清洗方法：
①以异丙醇作溶剂冲洗：
②放在异丙醇中间用超声波清洗；
③用10%稀硝酸清洗；
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。
11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相色谱常见故障的断定
及解决诊状可能的原因解决方法
（一）保留时间变化
1.柱温变化，柱恒温，必要时需配置恒温箱；
2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱；
3.缓冲液容量不够用25mmol/L的缓冲液；
4.柱污染每天冲洗柱；
5.柱内条件变化稳定进样条件，调节流动相
6.柱快达到寿命，采用保护柱
(二) 保留时间缩短
1.流速增加，检查泵，重新设定流速；
2.样品超载，降低样品量；
3.键合相流失，流动相pH值保持在3"7.5检查柱的方向；
4.流动相组成变化，防止流动相蒸发或沉淀；
5.温度增加，柱恒温；
(三) 保留时间延长
1.流速下降管路泄漏，更换泵密封圈，排除泵内气泡；
2.硅胶柱上活性点变化，用流动相改性剂，如，加三乙胺，或采用碱至钝化；
3.键合相流失，同前(二)3
4.流动相组成变化，同前(二)4
5.温度降低，同前(二)5
（四）出现肩峰成分
出现肩峰成分：
1.样品体积过大，用流动相配样，总样品体积小于第一峰的15%；
2.样品溶剂过强，采用较弱的样品溶剂；
3.柱塌陷或形成短路通道，更换色谱柱，采用较弱腐蚀性条件；
4.柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢，加在线过滤器，过滤样品；
5.进样器损坏，更换进样器转子；
(五) 鬼峰
1.进样阀残余峰，每次用后用强溶剂清洗阀，改进阀和样品的清洗；
2.样品中未知物，处理样品；
3.柱未平衡，重新平衡柱，用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)；
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)每天新配，用抗氧化剂；
5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水；
（六）基线噪声
1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气，加柱后背压
2.污染(随机噪声) 清洗柱，净化样品，用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声，更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声)，采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡，流动相脱气，加柱后背压
(七) 峰拖尾
1.柱超载，降低样品量，增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰，清洁样品，调整流动相
3.硅羟基作用，加三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值，钝化样品；
4.同前(四)4 同前(四)4
5.同前(四)3 5.同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大，连接点降至最低，对所有连接点作合适调整，尽可能采用细内径的连接管；
7.柱效下降，用较低腐蚀条件，更换柱，采用保护柱；
(八) 峰展宽
1.进样体积过大，同(四)1；
2.在进样阀中造成峰扩展，进样前后排出气泡以降低扩散；
3.数据系统采样速率太慢，设定速率应是每峰大于10点；
4.检测器时间常数过大，设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%；
5.流动相粘度过高，增加柱温，采用低粘度流动相；
6.检测池体积过大，用小体积池,卸下热交换器；
7.保留时间过长，等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱；
8.柱外体积过大，将连接管径和连接管长度降至最小；
9.样品过载，进小浓度小体积样品；
液相色谱柱使用经验谈
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
1.样品的前处理：
a.最好使用流动相溶解样品。
b.使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c.使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2.流动相的配制：
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流 动相具备以下的特点：
a.流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b.流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c.流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d.流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如，使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e.流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f.在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3.流动相流速的选择：
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mL/min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如，使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
a.由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
c.含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
d.流动相要求使用0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。
e.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
高效液相色谱仪操作步骤：
1)过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2)对抽滤后的流动相进行超声脱气10～20分钟。
3)打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5)有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10mL/min。
6)调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。
7)设计走样方法。点击file，选取select users andmethods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。
选完后，点击protocol，一个完整的走样方法需要包括：
a.进样前的稳流，一般2～5分钟；
b.基线归零；
c.进样阀的loading-inject转换；
d.走样时间，随不同的样品而不同。
8)进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9)关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10)填写登记本，由负责人签字。
注意事项：
1)流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2)柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
3)所有过柱子的液体均需严格的过滤。
4）压力不能太大，最好不要超过2000psi
点击查看相关文章
1.精华|HPLC最实用的30个常见问题及对策（一）
4.UPLC获美国药典认可！千万别不懂HPLC与UPLC方法转换。。
5.收藏版】HPLC四大常见故障及解决方法
6.HPLC溶剂的选择及使用二三事
（本文由实验与分析编辑整理，部分资料参考网络。版权所有，转载请联系小析姐，征得同意后方可转载，并在显眼处注明来源，否则一律做侵权行为处理，谢谢大家关注！）
实验与分析人的
「抱团学习成长」社群
小析姐喊你 归！队！啦！
【社群大本营】
实验与分析人社区、实验室建设与管理群、重金属检测技术交流群、样品前处理技术群、光谱应用技术交流群、色谱应用技术交流群、质谱应用技术交流群、微生物检测技术交流群、乳品检测技术交流群、环境技术检测技术交流群、药物研发与质控群。
加入社群大本营, 请呼叫「小析姐」接受定向邀请。
小析姐微信号casellihuang、w15846599033、angel4116567
发送暗号：姓名、单位、岗位+ 目标社群