53年前，瑞士生化学家从手术绷带的脓血中成功分离出DNA（当时称为“核蛋白”），从此人类便开启了DNA的探索之旅，也将看不见摸不着的DNA带入了大众的视野。怎样验证细胞中DNA的存在？又如何成功提取DNA？这些疑问是人类深入挖掘DNA奥秘的起始与关键。今天，小编与生物大咖们一起从教材入手，共同解析《DNA的粗提取与鉴定》实验。
其他
如何进行DNA的粗提取与鉴定？
实验原理
DNA提取的原理为裂解细胞，使细胞中的核酸和大分子物质释放出来，然后用一系列的试剂纯化，最后得到DNA的过程。
1、研磨液中的变性剂SDS是去污剂的主要成分，能溶解细胞膜，可促使细胞破裂，释放出DNA，并使得蛋白质变性，抑制DNA酶活性；NaCl利于提取时DNA溶解在研磨液中；EDTA是一种金属离子螯合剂，螯合金属二价阳离子，降低DNA酶活性，减少DNA分解；Tris是缓冲液的主要成分，稳定溶液pH值，防止DNA在pH发生变化时降解或变性。
2、DNA不溶于酒精，而细胞中的某些物质溶于酒精。因此，可用乙醇进一步提取出含杂质较少的DNA。
3、DNA中的嘌呤核苷酸中的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，在沸水浴条件下，它和二苯胺试剂反应使溶液呈蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
4、微量可调移液器、电子天平、研磨过滤器、水浴锅、铝制试管架、试管、吸头、吸头盒、油性记号笔等。
5、植物DNA粗提取与鉴定试剂盒、无水乙醇、纯水/蒸馏水。
实验方法与步骤
在加入DNA粗提物的试管中，颜色变为蓝色；而空白对照的试管中无颜色变化，说明通过实验系列操作，成功提取菜花中的DNA。
4、更多实验结果
实验成功关键
充分研磨，DNA释放的量更多，提取与鉴定效果则更加明显。较之传统的研磨工具，研磨过滤器具有研磨更快速、充分、安全等优势。提取与分离一“器”呵成。应用广泛，除本实验外，《叶绿素的提取与分离》及研磨相关的实验均可使用。
提取过程中，加入冷的无水乙醇时，需倾斜试管，吸头接触试管斜面缓慢加入试管中，切忌快速加入时冲散已析出的DNA，并顺着一个方向快速旋转试管，使得絮状物析出并凝结成团，切勿剧烈震荡，以免絮状物破碎。
二苯胺是实验鉴定的关键试剂，因此选择专业的试剂盒产品，是试剂品质保障的前提。其次配制过程中不仅要掌握A、B液的配比，更要遵循“现配现用”的基本原则，才可以取得理想的实验效果。
专业的仪器设备、高品质的试剂耗材，科学的实验方法，掌握实验的关键细节，任何实验都可以“不攻自破”。
注意事项
1、DNA提取时，EP管和枪头等耗材要先进行高压蒸汽灭菌，去除DNA酶（无酶无菌耗材除外）。
2、实验前，需保证细胞状态活性良好。如细胞死亡，提取的DNA不完整。
3、由于实验过程存在有机试剂，实验操作人员严格穿戴实验服和手套。保障自身安全。
质粒提取方法
质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。
1、碱裂解法：
此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
1.接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2.37°℃振荡培养过夜。
3.取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4.加加o.1lm1溶液I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0,25mML Tris-HC1 pH8.0)充分混合。
5.加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1% SDS)，车轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6.加入0.15m1预冷溶液III(5 molLKAc, pH4.8),轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7.以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管
8.加入等体积的异戊醇，混匀后于0℃静置10min。
9.再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10.用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11.待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中
2、煮沸法
1.将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4C下12000g离心30秒。
2.弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3.将菌体沉淀悬浮于120m1 STET溶液中，涡旋混匀。
4.加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，涡旋振荡3秒钟。
5.将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。
6.用微量离心机4C下12000g离心10分钟。
7.用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8.取20ml进行电泳检查。
3、酚氯仿裂解法
1.从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 ug/mL)摇菌12 h;收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 _uL TE，充分混匀;加入400 uL酚氯仿(1 : 1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀;12 000g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层;上清经国产0。22 um针式滤器过滤1次;向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s,12 000 g/min离心5 min;沉淀溶于20uL的RTE溶液中，37℃水浴。
2.按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37°C，1h)。酶切产物10 uL,10 g/L琼脂糖凝胶电泳。3.PCR引物根据参考文献设计，预计扩增产物片断大小为714 bp。
4.常规制备感受态菌E。coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素(30 umL)LB培养平板中，37C培养，15 h后观察筛选克隆情况。
文章来源：生命科学教育 医思倍研究院 信裕生物
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责任编辑：胡静
审核人：邢海涛