谁还在为玩不转LC-MS而烦恼？
如果您想优化一下LC-MS，可知道条件优化的一般顺序是什么？优化质谱条件，样品是从针泵进样来优化参数？还是从液相进样来优化呢？能不能开始的时候用个两通来取代柱子，先优化下质谱的条件，使信号最强，再接上柱子，优化液相的条件？
换个说法，大家做液质的时候都是怎么个流程呢？某网友说：“先用质谱优化的是它的离子对检测，和各种电压和温度。然后才是液相梯度和比例，调整出峰时间。不同的柱子响应也会不同。所以是要优化两步。第一是质谱，然后是液相。”对？不对？请看下文！
LC-MS联用需要克服的困难
简单的说，液质联用的色谱条件选择：色谱柱、流动相组成、pH值和缓冲盐、流速；
质谱条件选择：准分子离子和碎片离子、碰撞诱导解离条件、考察生物样品的基质效应、与色谱条件的匹配；
各种条件和参数的进一步优化：考察选择性、考察灵敏度、考察线性关系、考察重现性。
首先：实验条件优化
调机准备：
• 仪器平衡时间：真空，温度，LC流动相比例，宁可长些。
• 容器注意，塑料离心管添加剂很容易混入，尤其是被有机溶剂浸泡时间较长时，干扰物信号有可能超过待测物。
• LC PUMP脱气，先放掉柱前部管路中液体,排净气泡，还要注意储液瓶液面高度。
其次，质谱定量方法和内标的选择
这里，你需要知道：离子源参数的优化设置直接影响分析的灵敏度和稳定性
选择离子化方法
• 碱性化合物宜用正离子方式，酸性化合物宜用负离子方式，如未知,可能正负都要做,有
些化合物正负都出峰,选择灵敏度高的方式,不明确的优先用正离子方式试 。
特别强调：必须要有成熟规范的样品制备方法
样品处理的好坏直接关系到整个LC-MS分析的成败，必须要有成熟规范的样品制备方法。
• 样品预处理各步不能随意省略,如萃取、分离、去盐等。某些化合物必须化学衍生化以适应LC-MS要求，如磷酸酯水解。
• 若MS信号实在太低,考虑换另外的样品处理方法。
• 浓度非常低的样品不能保存太长时间, 容器吸附、分解等原因使样品浓度降低，标准品工作液现配现做.
LC-MS条件优化分类说明
MS条件优化—— 先定性后定量
● 首先，确定离子化方式：ESI or APCI，POS or NEG
● 用10-100ppm的纯样，Q1 SCAN 察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP,观察离子的增减,若为POS方式，看M+1，M+18，M+23等等,初步判断分子离子,如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不合适；
● 母离子选M+H,或M-H最好,但有时只有M+NH4,M+Na等,这样CAD能量可能需要高些,选择[M+H]+，还是+NH4，+Na等，要由化合物决定。加合离子若稳定，则可用，不稳定则可能需换流动相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高；如含Cl可选择2个母离子峰；
● SIM与MRM，单级Q只能SIM，MRM可看成2个SIM，选择性更好；
● 再根据上一步确定的母离子进行PRODUCT SCAN，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。还可改变CE，从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对,为最后LC-MS/MS联用做准备；
● 做PRODUCT SCAN时，注意小数点后的位数,MRM输入要准,灵敏度才高；
● 先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定离子对数目；
● MRM方式优化仪器，通过优化仪器参数，使得母、子离子都达到一定强度水平，使MRM灵敏度最高。可先让仪器自动优化参数，然后再手动细致优化，只检测一对离子时根据TIC的强度来确定仪器参数，一次优化多对离子时，要根据每对离子的XIC强度来分别确定仪器参数；
● 先用注射泵优化COMPOUND项下面的参数，如DP、CE及CAD等，再接通LC，用FIA优化其他参数如温度，气流和IS电压及离子源位置，或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC保持需要的流量. 然后进行MRM测定。
● CURTAIN GAS在不降低灵敏度情况下尽量大些，雾化辅助加热气流不用太大，这样可以提高信噪比，保持信号稳定。
● 分辨率的选择：当样品较纯，Q3可选LOW，提高灵敏度，若选LOW后本底噪声太高则意义不大。
LC条件优化：
● 色谱柱长度可根据分离的要求而定，定性可长些,定量在能有效排除干扰情况下尽量短,提高效率；内径最好选细径柱如2mm的,1mm的,IS可不分流, 4.6mm柱用1ml流量时如不分流灵敏度还不是最佳,不如流量低时更好。流速高，峰形好；
● 不同牌号色谱柱，效果很可能不同；
● PH的影响-正离子方式PH要低些，负离子方式PH要高些，除对离子化有影响外，还影响LC的峰形，以至定量误差。流动相加乙酸铵可适合大部分测定要求；
● 用流动相配的标样，初步优化确定LC条件是否合适；
● 标准品工作液现配现做，尤其是较低浓度，时间长了可能因吸附分解等降低；
● 进样顺序要先稀后浓；
● 洗针液要常换，进过浓样后要进一针空白，检验是否有残留污染；
● 顺序：纯样-添加样-实际样品；
● 流动相液优化后，空白提取液配制标准再优化，看干扰，空白添加再提取后看回收率；
● 用空白提取液配制标准样做曲线，准确，有效排除干扰因素。
前处理方法的优化
● LC，MS都优化还不行，改提取方法
● 离子抑制-改变前处理方法或LC条件
● 内标用法，药代动力学时多采用内标，选择原则：内标物与被测物的化学性质有区别时，要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，尽量选同系物。还可利用同位素标记
● 衍生化：有时有助于信号强，且稳定，例如硝基呋喃类，衍生化后容易测量
数据处理
● 最低检出限，信噪比～3:1，定量限～10:1
● 同一物质几对离子的比例应相对恒定，误差不超过15%，峰面积比峰高准确
● 当浓度低，信号弱，自动积分不准时可对峰面积手动积分
● 平滑次数与峰宽因子、保留时间等设置都会影响积分值
● 曲线过零点时，可用4个点；不用，则要5个点
● 线性范围太宽，有时意义不大
附：LC-MS最佳分析条件的选择
1.LC分析条件的选择
LC分析条件的选择要考虑两个因素：使分析样品得到最佳分离条件并得到最佳电离条件。如果二者发生矛盾，则要寻求折中条件。LC可选择的条件主要有流动相的组成和流速。在LC和MS联用的情况下，由于要考虑喷雾雾化和电离，因此，有些溶剂不适合于作流动相。不适合的溶剂和缓冲液包括无机酸，不挥发的盐（如磷酸盐）和表面活性剂。不挥发性的盐会在离子源内析出结晶，而表面活性剂会抑制其它化合物电离。在LC-MS分析中常用的溶剂和缓冲液有水，甲醇、甲酸、乙酸、氢氧化铵和乙酸铵等。对于选定的溶剂体系，通过调整溶剂比例和流量以实现好的分离。值得注意的是对于LC分离的最佳流量，往往超过电喷雾允许的最佳流量，此时需要采取柱后分流，以达到好的雾化效果。
2.质谱条件的选择
质谱条件的选择主要是为了改善雾化和电离状况，提高灵敏度。调节雾化气流量和干燥气流量可以达到最佳雾化条件，改变喷咀电压和透镜电压等可以得到最佳灵敏度。对于多级质谱仪，还要调节碰撞气流量和碰撞电压及多级质谱的扫描条件。
在进行LC-MS分析时，样品可以利用旋转六通阀通过LC进样，也可以利用注射泵直接进样，样品在电喷雾源或大气压化学电离源中被电离，经质谱扫描，由计算机可以采集到总离子色谱和质谱。
3.LC-MS数据的采集和处理
与GC-MS类似,LC-MS也可以通过采集质谱得到总离子色谱图（图9.23）。此时得到的总离子色谱图与由紫外检测器得到的色谱图可能不同。因为有些化合物没有紫外吸收,用普通液相色谱分析不出峰，但用LC-MS分析时会出峰。由于电喷雾是一种软电离源,通常很少或没有碎片,谱图中只有准分子离子（见9.3.2），因而只能提供未知化合物的分子量信息，不能提供结构信息。很难用来做定性分析。
为了得到未知化合物的结构信息，必须使用串联质谱仪，将准分子离子通过碰撞活化得到其子离子谱，然后解释子离子谱来推断结构。如果只有单级质谱仪，也可以通过源内CID得到一些结构信息。
4.LC-MS定性定量分析
LC-MS分析得到的质谱过于简单，结构信息少，进行定性分析比较困难，主要依靠标准样品定性，对于多数样品，保留时间相同，子离子谱也相同，即可定性，少数同分异构体例外。
用LC-MS进行定量分析，其基本方法与普通液相色谱法相同。即通过色谱峰面积和校正因子（或标样）进行定量。但由于色谱分离方面的问题，一个色谱峰可能包含几种不同的组份，给定量分析造成误差。因此，对于LC-MS定量分析，不采用总离子色谱图，而是采用与待测组分相对应的特征离子得到的质量色谱图或多离子监测色谱图，此时，不相关的组分将不出峰，这样可以减少组份间的互相干扰，LC-MS所分析的经常是体系十分复杂的样品，比如血液、尿样等。样品中有大量的保留时间相同、分子量也相同的干扰组分存在。为了消除其干扰，LC-MS定量的最好办法是采用串联质谱的多反应监测（MRM）技术。即，对质量为m1的待测组份做子离子谱，从子离子谱中选择一个特征离子m2。正式分析样品时，第一级质谱选定m1，经碰撞活化后，第二级质谱选定m2。只有同时具有m1和m2特征质量的离子才被记录。这样得到的色谱图就进行了三次选择：LC选择了组份的保留时间，第一级MS选择了m1，第二级MS选择了m2,这样得到的色谱峰可以认为不再有任何干扰。然后，根据色谱峰面积，采用外标法或内标法进行定量分析。此方法适用于待测组份合量低，体系组份复杂且干扰严重的样品分析。比如人体药物代谢研究，血样，尿样中违禁药品检验等。图9.24是采用MRM技术分析的例子，上图为样品的总离子色谱图,下图为选定特征离子m/z309和m/z241后，利用MRM得到的色谱图 。
LC-MS分析某物质时，如何进行条件优化，优化时应注意些什么？另外，HPLC 中溶剂峰峰位及如何解决？
LC-MS应该在流动相组成及酸的百分含量以及正负离子模式检测等方面优化，最好在HPLC条件下先优化好色谱条件，再进行LC/MS分析。注意流动相的配置中最好别用磷酸盐之类的，如必须用，换冰乙酸调pH好点。质谱条件优化ESI一般优化喷雾电压，APCI优化放电电流，source CID，气压等等，不同品牌的质谱仪叫法不一样的，还有的是手动优化，有的是自动优化。
溶剂在质谱离子源中是雾化了的，不进入质量检测器，所以对质谱检测影响不大。溶剂峰的锋位置，可以通过调节流动相及其分流比来改变。
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