温东辉教授 | 抗生素抗性基因的分布及去除：A2/O生活污水处理系统

研究背景

通过粪便、尿液等排泄物排出生物体的抗生素（antibiotics）作为特殊的环境选择压力，使携带抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）的微生物成为优势物种，来自内在抗性与外源输入的ARGs在人类、动物、生态环境间不断复制、传递和循环，被ARGs感染后的细胞将使相应的抗生素失效，给人类健康和生态安全带来重大威胁。

1

选取河北省某A²/O生活污水处理系统为研究对象，对污水、污泥处理工艺沿程各单元样品的胞内、胞外ARGs进行试验分析，揭示生活污水处理系统中胞内、胞外ARGs的分布变化与去除效率。

2

对生活污水处理系统污水、污泥处理工艺沿程各单元胞内和胞外ARGs、I型整合子IntI1的绝对、相对丰度进行分析，并将其与样品水质因子pH、COD、NH₃-N等数据进行相关性分析。

摘  要

生活污水处理系统是抗生素抗性基因（ARGs）重要的“汇”和“源”。为探究ARGs在生活污水处理系统包括污水、污泥处理单元全流程的分布变化和去除效率，选取了河北省某A²/O生活污水处理系统，使用普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术对污水、污泥处理工艺沿程各单元的胞内、胞外ARGs的丰度变化及去除效果进行研究。在污水处理系统中对tetC、sulⅡ、ermB、blaPSE-1四种ARGs、I型整合子IntI1以及16S rDNA进行了检测。在总进水中，总胞内ARGs和胞外ARGs绝对丰度分别为1.30×10⁸ copies/mL和2.09×10² copies/mL，总胞内ARGs和胞外ARGs相对丰度分别为3.16×10^-2，5.29×10^-1。最终出水的总胞内ARGs和胞外ARGs绝对丰度去除log值分别达到2.10log和-3.20log，总胞内ARGs和胞外ARGs相对丰度去除log值分别达到-0.21log和0.60log。泥区废液总回流液的回流会增大总进水胞外ARGs负荷。相关性研究表明，I型整合子IntI1可能会促进tetC、ermB、blaPSE-1的传播，水质因子可能会影响ARGs的分布与扩散。

污水处理系统简介

选取河北省某A²/O生活污水处理系统（编号为YJ）为研究对象，主体工艺为A²/O工艺，处理后的污水达到国家一级A标准。对污水处理系统进行了基本信息参数的调研，汇总如表1所示。具体的污水、污泥处理工艺流程及采样点分布如图1所示。

表1  YJ污水处理系统基本信息参数

图1  YJ污水处理系统工艺流程及采样点分布示意

为了使所选目标待测基因具有一定的代表性，尽可能选择近年来研究检出频率及丰度较高的、不同种类且具有不同耐药作用机制的ARGs（例如tetC属于“外输泵”类机制，sulⅡ属于“目标分流”类机制，ermB属于“目标改性”类机制等）进行研究，同时近年来有研究表明I型整合子对ARGs的污染传播扩散起到了重要作用。普通PCR定性检测结果显示，YJ生活污水处理系统样本中存在tetC、sulⅡ、ermB、blaPSE-1、IntI1、16S rDNA 6种基因，且琼脂糖凝胶电泳条带清晰明亮，如图2所示。

图2  部分基因琼脂糖凝胶电泳结果

结果与讨论

No.1

污水处理系统中胞内、胞外基因绝对丰度分布及去除log值

YJ生活污水处理系统污水、污泥处理工艺沿程各单元胞内和胞外ARGs、I型整合子IntI1、16S rDNA绝对丰度如图3a、3b所示。

图3a  YJ污水处理系统胞内基因绝对丰度

图3b  YJ污水处理系统胞外基因绝对丰度

1.污水处理工艺

在总进水中，胞内ARGs的绝对丰度占有绝对主导地位，4种ARGs绝对丰度的数量级为10⁶~10⁷（胞内）、10⁰~10²（胞外），胞内ARGs总绝对丰度达到1.30×10⁸ copies/mL，胞外则为2.09×10² copies/mL。

在经过细格栅与旋流沉砂池作用后，对胞内基因具有较小的去除作用，而对胞外基因具有明显的富集作用。

污水经过A²/O生化池作用后，胞外基因可能与生化池微生物发生了强烈的水平基因转移，而微生物对不同的胞外基因作用效果不同。

经过二沉池后，各胞内基因都随着污泥沉降而大幅度减少。

对于二氧化氯消毒出水，总胞外ARGs绝对丰度仅比总胞内ARGs绝对丰度低0.49个数量级。

该生活污水处理系统对胞内ARGs绝对丰度整体表现为持续下降的趋势，表明该污水处理流程对胞内ARGs具有一定的削减去除作用，能够降低进水的抗性风险。

2.污泥处理工艺

泥区废液总回流液、二沉池污泥回流液、脱水机房冲洗液(含/不含污泥脱水滤液)、污泥浓缩池上清液胞内ARGs绝对丰度达10⁶~10⁸数量级。泥区废液总回流液的胞内ARGs绝对丰度低于总进水，回流有利于进行胞内ARGs的稀释。但对于胞外ARGs绝对丰度，污泥处理流程单元总胞外ARGs绝对丰度可达10⁴~10⁵数量级，远大于总进水，回流操作会增大总进水的胞外ARGs负荷，也解释了旋流沉砂池出水胞外ARGs绝对丰度远大于总进水的原因所在。对于脱水前、后污泥，各基因及总胞内ARGs绝对丰度基本保持不变，可以判断污泥脱水压滤机基本没有使细胞发生破壁现象，胞内基因并没有释放至胞外。

No.2

污水处理系统中胞内、胞外基因相对丰度分布及去除log值

YJ生活污水处理系统污水处理工艺、污泥处理工艺沿程各单元胞内和胞外ARGs、I型整合子IntI1相对丰度如图4a、4b所示。

图4a  YJ污水处理系统胞内基因相对丰度

图4b  YJ污水处理系统胞外基因相对丰度

1.污水处理工艺

污水处理系统污水处理流程的总进水中，胞外ARGs的相对丰度远高于胞内ARGs相对丰度，4种ARGs相对丰度的数量级为10^-4~10^-2（胞内）、10^-2~10^-1（胞外），胞内ARGs总相对丰度达到3.16×10^-2，胞外ARGs总相对丰度则为5.29×10^-1。通过高相对丰度的胞外ARGs可以判断，自然环境中存在大量携带有抗生素抗性基因的DNA片段，易会导致水平基因转移的发生，抗性风险的传播。

细格栅与旋流沉砂池作用对胞外基因相对丰度的去除作用强于胞内基因。

污水经过A²/O生化池作用后，胞内相对丰度较旋流沉砂池出水分别下降，胞外基因变化趋势因基因而异，生化单元可以降低部分ARBs在微生物群落中比例。

经过二沉池后，与绝对丰度的情况截然相反，胞内微生物量少却含有较高比例的ARGs，胞外DNA量大却含有较低比例的ARGs，二者均具有较高风险。

纤维滤池转盘单元对胞内基因相对丰度作用不明显，而对胞外基因相对丰度产生了强烈的富集作用。

二氧化氯消毒出水对各基因的相对丰度影响不一，可能与基因种类有关。已有研究表明，消毒剂量是影响ARGs消减效果的重要因素，CT值（消毒剂浓度×接触时间）的变化对不同的ARGs的削减效果影响不同，甚至可能会产生负作用。

2.污泥处理工艺

泥区废液总回流液、二沉池污泥回流液、脱水机房冲洗液(含/不含污泥脱水滤液)、污泥浓缩池上清液总胞内、总胞外ARGs相对丰度达10^-3~10^-2数量级、10^-2~10⁰数量级。泥区废液总回流液的胞内、胞外ARGs相对丰度均低于总进水，回流有利于进行胞内、胞外ARGs相对丰度的稀释。

No.3

基因、水质因子的相关性

将污水、污泥处理工艺沿程各单元的tetC、sulⅡ、ermB、blaPSE-1、IntI1、16S rDNA的胞内外绝对丰度、相对丰度和样品水质因子pH、COD、NH₃-N等数据进行相关性分析，主要结果如下。

对污水处理工艺沿程各单元胞内基因绝对丰度、水质因子相关性分析发现，IntI1基因在污水处理工艺沿程的tetC、ermB、blaPSE-1的传播扩散中起到了较强作用，且这3种ARGs的传播机制可能类似。sulⅡ与IntI1的在污水处理工艺中的变化与微生物总量的变化有关。16S rDNA与污水pH呈现显著负相关。tetC、ermB、blaPSE-1、IntI1与污水COD呈现显著正相关，表明这4种基因受污水中有机物浓度影响。

对污水处理工艺沿程各单元胞外基因绝对丰度、水质因子相关性分析发现，tetC、sulⅡ均与ermB呈现显著正相关，说明这3个基因在细胞外的传播机制可能类似。IntI1与污水的COD成显著负相关，同时与污水的NH₃-N成显著负相关，16S rDNA也与COD、NH₃-N成显著负相关，表明污水在被逐级处理的同时，水体中的胞外DNA逐渐增多，可能胞内DNA由于细胞破壁释放至胞外所致。

对污泥处理工艺沿程各单元胞内基因丰度、水质因子相关性分析发现，blaPSE-1绝对和相对丰度与NH₃-N成显著正相关。

对污泥处理工艺沿程各单元胞外基因相对丰度、水质因子相关性分析发现，tetC、sulⅡ、ermB、blaPSE-1均与NH₃-N呈现显著正相关，也表明水体中NH₃-N减少可能可以降低污泥处理流程中胞外ARGs在胞外DNA中的占比，减少风险。

 重要结论

1）河北省某A²/O生活污水处理系统存在抗性风险。在污水处理系统中对抗生素抗性基因tetC、sulⅡ、ermB、blaPSE-1，I型整合子IntI1，16S rDNA进行了检测。总进水的总ARGs绝对丰度达到1.30×10⁸ copies/mL（胞内）、2.09×10² copies/mL（胞外），总ARGs相对丰度达到3.16×10^-2（胞内）、5.29×10^-1（胞外）。ARGs作为一种新型污染物“汇”入生活污水处理系统。

2）污水处理最终出水的总ARGs绝对丰度去除log 值达到2.10log（胞内去除）、-3.20log（胞外富集），总ARGs相对丰度去除log 值达到-0.21log（胞内富集）、0.60log（胞外去除）。该污水处理系统作为ARGs的“源”进入生态环境，可能会威胁人类健康与生态安全。靶向设计同时去除水体胞内、胞外ARGs 绝对丰度、相对丰度的污水处理技术是减少乃至消灭抗性污染的关键，有待后续进一步研究。

3）泥区废液总回流液的回流有助于总进水胞内ARGs绝对丰度、相对丰度和胞外ARGs相对丰度的降低，但会造成胞外ARGs绝对丰度增加，增大总进水的胞外ARGs负荷。

4）相关性研究表明，I型整合子IntI1可能会促进tetC、ermB、blaPSE-1在污水处理系统中的传播，控制污水的水质可能会影响ARGs的分布与扩散。

来源：谢辉,包樱钰,李菲菲,温东辉,陈吕军.A2/O生活污水处理系统中抗生素抗性基因的分布及去除[J].环境工程.

（该篇文章即将刊载于《环境工程》，点击此处可查看全文链接）

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