【基础研究】基于超高效液相色谱-串联质谱的组织代谢组学分析在股骨头坏死中的应用

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文章来源 : 中华骨科杂志, 2016,36(07): 429-436

作者：朱卫文 杨刚 徐开民 徐忠玮 张健

摘要  

目的

应用代谢组学分析方法探索股骨头坏死的组织代谢特征并寻找其潜在的生物标志物。

方法

分别收集23例（25髋）股骨头坏死和18例股骨颈骨折患者的股骨头组织标本，行病理学检查明确诊断。萃取骨组织标本代谢物，采用超高效液相色谱-质谱/质谱串联仪检测，对检测结果进行预处理，建立主成分分析（principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法判别分析（partial least-squares discriminant analysis ，PLS-DA）及正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型。根据PLS-DA模型和多个独立样本的Kruskal-Wallis H检验筛选差异变量，依据一级和二级质谱推定其对应的代谢物。筛选两组峰强度变化最明显的代谢物作为潜在的生物标志物，通过二元Logistic回归进行受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，评价其诊断意义。

结果

股骨头坏死和股骨颈骨折患者的股骨头骨组织代谢物表达模式在PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型中均能明显区分。股骨头坏死组表达高于股骨颈骨折组的代谢物有D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、肌苷、尿嘧啶、尿苷、LysoPC (20∶4 (5Z, 8Z, 11Z，14Z））、LysoPC (16∶0）、PC (20∶1 (11Z）/18∶3 (6Z, 9Z, 12Z））、PE (P-16∶0e/0∶0）；低于股骨颈骨折组的有柑橘叶黄素、β-隐黄质。根据峰强度改变倍数、变量权重型投影值筛选出改变最为明显的三种物质是D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺，ROC曲线下面积分别是0.873、0.712、0.862，三种代谢物联合ROC曲线下面积为0.946。

结论

通过股骨头坏死和股骨颈骨折的骨组织代谢物PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型可筛选出12种代谢物，其中D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺为潜在的股骨头坏死生物标志，其联合诊断的价值较高。

股骨头坏死是一种常见的致残性疾病[]，好发于壮年，给社会和家庭带来了巨大的经济负担[,]。股骨头坏死的主要病理学改变为股骨头血供中断或受损引起骨细胞坏死、纤维化及骨小梁空泡形成[,]；随疾病进展，股骨头软骨下骨发生骨折，股骨头塌陷，最终发生髋关节退行性改变，引起关节疼痛及关节功能障碍[]。股骨头坏死常见的病因有创伤、糖皮质激素应用、酒精中毒、高脂血症、怀孕、系统性红斑狼疮、固体器官移植和减压病等，确切的发病机制目前尚不清楚[,]。临床诊断主要依据症状、体征、X线及MRI表现[]。其中MR检查对早期诊断有一定的意义，但由于易受干扰且价格昂贵，难以用于筛查。股骨头坏死早期无特异性表现且易与类风湿关节炎、骨关节炎及单纯的软骨下骨折混淆，因此其早期诊断比较困难。

分子标志物的确定有利于疾病的早期诊断，近年来股骨头坏死特异标志物的研究也日益受到关注。目前通过蛋白组学的方法及传统方法证实可能的股骨头坏死大分子生物标志有脂蛋白、P-糖蛋白、锌-2-糖蛋白、血管内皮生长因子、人类软骨糖蛋白-39，但具体诊断价值尚不明确[]。

代谢组学是近年来兴起的一门学科，它与基因组学、蛋白质组学、生物信息组学共同构成了系统生物学，其应用有助于了解疾病的代谢变化及发现疾病的小分子标志物[]。代谢组学已成功应用于类风湿关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎等骨科疾病的研究[]，但目前尚无应用于股骨头坏死的研究报道。

我们采用回顾性研究方法，收集手术切下的股骨头坏死标本和股骨颈骨折患者切下的股骨头标本，行病理学检查以明确诊断。应用超高效液相色谱-质谱/质谱串联（ultra high performance liquid chromatographymass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-MS/MS ）技术分析两组标本的代谢物。对所测得的变量建立疾病的主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判别分析（partial least-squares discriminant analysis ，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型，经过OPLS-DA和多个独立样本的Kruskal-Wallis H检验，找出差异变量。通过HMDB和Massbank比对，确定其差异变量对应的物质，并对改变明显的差异物质进行ROC曲线分析。研究目的：①寻找股骨头坏死的潜在生物标志物，并评价其诊断价值；②探讨潜在标志物参与疾病的可能机制。

材料与方法

一、主要仪器、试剂和软件

主要仪器包括超高效液相色谱LC-20AD（岛津，日本）、质谱仪（Triple TOF 5600，AB SCIEX，美国）、色谱柱（Kinetex XB-C18 ，100 mm×2.1 mm，2.6 μm ，菲罗门，美国）、高通量组织研磨机（SCIENTZ-48，宁波新芝生物科技股份有限公司，中国）、OA-SYS氮吹仪（Organomation，美国）、桌上型超速离心机SIGMA1-14 （Sigma，德国）、涡旋仪Vortex Genius 3（艾卡，德国）、AS-3120超声仪（天津AutoScience仪器有限公司，中国）。

主要试剂包括乙腈（色谱纯，TEDIA，美国）、甲酸（色谱纯，Sigma-Aldrich，美国）、甲醇（色谱纯，成都市科龙化工试剂厂，中国）；二氯甲烷（分析纯，重庆川东化工有限公司，中国）。

主要软件有MarkerView 1.2.1软件（AB SCIEX，美国）、Shortcut to PeakView (AB SCIEX，美国）、SIM-CA-P13.0软件（Umetrics，瑞士）。

二、标本制作

本研究通过重庆医科大学附属第一医院伦理委员会审核，在研究开始之前所有患者均签署了知情同意书。

股骨头坏死病例纳入标准：①X线片、MRI及病理学表现均符合股骨头坏死诊断；②Ficat分期为Ⅲ期或Ⅳ期，需行全髋关节置换者。排除标准：①有代谢性骨病或有代谢性骨病病史者；②有严重骨质疏松者。股骨颈骨折病例纳入标准：①X线片、MRI及病理学表现均符合股骨颈骨折诊断；②新鲜骨折，未并发创伤性股骨头坏死。排除标准：①有代谢性骨病或有代谢性骨病病史者；②有严重骨质疏松者；③病理性骨折者。

从2014年9月至2015年2月，按上述标准共获取23例股骨头坏死和18例新鲜股骨颈骨折患者的股骨头标本。股骨头坏死组将手术取下的坏死股骨头标本用骨刀劈开，在坏死区域（上内侧）皮质下用细骨刀切取黄豆大小组织；股骨颈骨折组也在相应区域取同样大小组织。以多聚甲醛固定、脱钙、石蜡包埋，切片后行HE染色，用光学显微镜观察。余下部分立即置入液氮保存。

股骨颈骨折组18例，男女各9例，年龄（63.39± 2.45）岁，身高（153.89 ± 3.496）cm，体重（49.33 ± 4.77）kg，体重指数（20.85±2.10）kg/m²；股骨头坏死组23例（25髋），男12例、女11例，年龄（59.70±9.43）岁，身高（155.17±4.22）cm，体重（50.48±6.65）kg，体重指数（21.00±3.02）kg/m²。

三、标本预处理

从液氮中取出骨组织标本，冰上解冻。每个标本均取50 mg，放入一粒5 mm直径和两粒1 mm直径的磁珠，加入200 μl超纯水，于高通量组织研磨机中以40 Hz的频率研磨5 min。按序加入溶剂：400 μl乙酸乙酯和乙醇混合液（1∶1），200 μl无水甲醇，200 μl无水甲醇和水混合液（3∶1），200 μl二氯甲烷和甲醇混合液（3∶1）。每加完一种溶液在研磨机中摇2 min，离心5 min，吸取上清液，全程在冰上操作。分别将各个样本的上述四次萃取上清液混匀（即样品代谢物萃取液），吸出1 ml于OA-SYS氮吹仪中常温下吹干。用100 μl甲醇和超纯水混合液（4∶1）复溶，振荡2 min，超声10 min，以12 000 r/min速度离心10 min^[]。吸取60 μl溶液用于UPLC-MS/MS分析，从每个样品剩余萃取液中吸出20 μl上清液混匀后作为质控（qualiy control ，QC）组。

四、样品分析

使用超高效液相色谱LC-20AD质谱仪进行UPLC-MS/MS分析，阳离子模式和阴离子模式均使用Turbo V ESI离子源。Triple TOF，注入Kinetex XB-C18柱子（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，Phenomenex，美国），流速0.35 ml/min。使用的流动相梯度为：溶液B（乙腈）在1％的浓度保持1 min，在12 min内将溶剂B浓度增加到85%，然后在12.1 min时降低到5%，全程分析在15 min时停止。雾化气体（空气）和涡旋气体（空气）均设为55 psi，加热温度为600 ℃。阳离子模式离子喷雾电压设为5 500 V，阴离子模式电压-4 500 V。气帘气（氮气）设为25 psi，不同目的碰撞池压力不同。碰撞能量为40 V （ESI+）或-40 V （ESI-），去簇电压：80 V (ESI+）或-80 V (ESI-）。大气压化学电离阳性校准解决方案作为参考物，用以保证准确性和重现性。在EMS模式中使用电离喷雾电离分析物，行全扫描分析，获取分析物的一级和二级质谱。扫描质量范围为50~1 000 m/z，扫描速率为1 000次／min。

在进样分析前先用5个QC来调试系统稳定性，然后每进5个样品后进一个QC来评价系统的稳定性，一个空白品（超纯水）冲洗柱子。

五、数据处理

使用质谱仪自带软件MarkerView 1.2.1对所提取的质谱数据进行峰检测、峰对齐、pareto缩放以及标准化，导出代谢物的质核比、保留时间及其对应的峰强度。使用80％去值原则^[]去除缺失值过多的变量，将得到的数据导入SIMCA-P 13.0对代谢物的峰强度进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析。在模型参数中，R²代表模型中相应主成分对整体变异的解释能力，Q²表示主成分对模型变异的预测能力。

用股骨头坏死组20个和股骨颈骨折组13个标本作为训练集建立PLS-DA模型；股骨头坏死组和股骨颈骨折组其余各5个标本数据集作为验证组，验证模型质量。利用7倍交叉验证对模型进行验证。将OPLS-DA分析中变量权重性投影（variable weight projection，VIP）值大于1的变量导出，应用SPSS 17.0 (IBM，美国）进行多个独立样本的Kruskal-Wallis H检验，将两组峰强度值差异有统计学意义（检验水准α值取双侧0.05）的变量保留。

将保留的变量导入质谱仪自带软件Shortcut to PeakView导出二级质谱，并在Massbank、HMDB数据库中比对二级质谱，找到其可能的对应物质。对其中VIP值>2，改变倍数>3的物质通过二元Logistic回归，进行受试者工作（receiver operating char-acteristic curve，ROC）曲线分析，测量曲线下面积。

将患者年龄、身高、体重和体重指数分别导入SPSS 17.0统计软件中，股骨头坏死和股骨颈骨折组差异的比较采用成组设计资料t检验，检验水准α值取双侧0.05。

    结果

一、患者的基本资料

股骨头坏死和股骨颈骨折组患者身高、体重、体重指数的差异均无统计学意义，而年龄的差异有统计学意义（）。为了排除年龄造成的组间差异，将所有患者按年龄≥60岁和<60岁分为两组进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析，三个模型均建立不成功，提示年龄的差异不会对股骨头代谢物造成明显影响。

二、组织病理学分析

股骨头坏死组镜下可见骨小梁间的骨髓细胞被一些无细胞结构的坏死物所替代。在坏死物周边可见中度纤维组织增生，缺少血管。坏死物周边骨小梁轻度肥大，骨细胞核无染色。股骨颈骨折组镜下骨小梁、骨间质、骨细胞均正常（）。

图1 组织病理学观察HE ×40 A股骨头坏死组，镜下可见在骨小梁中存在少量的坏死物和中度纤维组织增生，骨小梁轻度肥大，骨细胞核无染色。黑色箭头示坏死物，黄色箭头示骨小梁空泡，蓝色箭头示纤维组织浸润B股骨颈骨折组，镜下骨小梁、骨间质、骨细胞均正常

三、UPLC-MS/MS分析系统的稳定性评估

9个用于评价系统稳定性的QC溶液数据进行PCA分析。结果如所示，QC样本聚集性较好，且位于所有样本的靠中心位置，说明在整个分析过程中仪器系统的稳定性较好。

图2 QC组代谢物峰强度PCA模型的三维立体得分图。QC样本聚集性较好，且大致位于所有样本的中心位置

四、识别模型对疾病代谢状态的区分能力

在PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型中，股骨头坏死组和股骨颈骨折组均能很明显地区分（）。在PCA模型中，R²=0.738，Q²=0.639（）。PLS-DA模型中，R²X=0.673 ，R²Y=0.844 ，Q²=0.773（）。为排除该模型的过度拟合，对其进行置换检验，经500次置换检验后Q²=-0.144（），说明PLS-DA模型并未出现过度拟合。OPLS-DA模型中，R²X= 0.673 ，R²Y=0.844 ，Q²=0.781（）。

图3 代谢物的PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型得分图。"C"为股骨颈骨折组，"O"为股骨头坏死组A PCA模型得分图B PLS-DA模型得分图C置换检验结果D OPLS-DA模型得分图

五、潜在生物标志物的筛选

在OPLS-DA模型中，VIP值大于1，说明该变量对模型区分的贡献较大，该变量对应的物质可作为潜在的生物标志。经过对所选出的变量进行多个独立样本的Kruskal-Wallis H分析，保留股骨头坏死组与股骨颈骨折组差异有统计学意义的变量。在HMDB和MassBank中，分别比对一级质谱和二级质谱，确定变量可能对应的物质。两组有差异的代谢物包括D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、肌苷、尿嘧啶、尿苷、LysoPC （20∶4 (5Z，8Z，11Z，14Z））、LysoPC （16∶0）、PC (20∶1 (11Z）/18∶3 (6Z, 9Z, 12Z））、PE (P-16∶0e/0∶0）、柑橘叶黄素、β-隐黄质（）。与股骨颈骨折组比较，股骨头坏死组升高的代谢物为：D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、肌苷、尿嘧啶、尿苷，LysoPC (20∶4 (5Z, 8Z, 11Z, 14Z））、LysoPC (16∶0）、PC（20∶1 (11Z）/18∶3 (6Z, 9Z, 12Z））、PE (P-16∶0e/0∶0），降低的为柑橘叶黄素、β-隐黄质。

根据VIP值>2，改变倍数>3筛选后，D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺三种物质被保留下来。证明D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺在股骨头坏死组织中改变明显，可能是区分股骨头坏死和股骨颈骨折的潜在标志物。对这三种物质分别进行ROC分析，其曲线下面积分别为0.873、0.712、0.862。对D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺二元Logistic回归后行ROC曲线分析，其曲线下面积提高到0.946（）。

图4 联合诊断标志的受试者工作曲线，曲线下面积为0.946

    讨论

一、股骨头坏死的潜在生物标志物及其诊断价值

我们应用UPLC-MS/MS分别对股骨头坏死和股骨颈骨折组骨组织中的代谢物进行分析。通过建立PCA、PLS-DA、OPLS-DA三种模型可知股骨头坏死和股骨颈骨折代谢发生了明显改变。筛选出的12种差异代谢物有D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、肌苷、尿嘧啶、尿苷、LysoPC (20∶4 (5Z, 8Z, 11Z，14Z））、LysoPC (16∶0）、PC (20∶1 (11Z）/18∶3 (6Z, 9Z，12Z））、PE (P-16∶0e/0∶0）、柑橘叶黄素、β-隐黄质。这12种代谢物代表了股骨头坏死和股骨颈骨折组之间的差异，并且可能通过不同的代谢途径参与了疾病发生。其中D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺三种代谢物可作为股骨头坏死的候选诊断标志物，其曲线下面积均大于0.7，具有较好的诊断价值，这三种代谢物联合比任何一种代谢物都具有更高的诊断价值。与传统的研究方法相比，代谢组学方法从收集的大量代谢物数据中获取感兴趣的物质，因此不容易产生主观偏倚^[]。目前，代谢组学方法已经广泛应用于多种疾病的生物标志物探索和机制研究，如心血管疾病、青光眼、糖尿病、骨关节炎等^[,,]。但UPLC-MS/MS仪器敏感性过高，其结果易受环境因素的影响。

二、潜在标志物参与疾病的可能机制

有文献报道，脯氨酸是一种炎症微环境压力感应物质，其代谢产物Δ1-pyrroline-5-carboxylate是介导三羧酸循环和尿素循环的中间物质。因此，脯氨酸可能提示股骨头缺血、缺氧。另外，脯氨酸和骨胶原代谢相关，它能够激活导致基质金属蛋白酶降解骨组织胶原^[]。脯氨酸的产物羟脯氨酸与骨坏死密切相关，且羟脯氨酸已经被认为是一种骨坏死的生物标志物^[]。此外，脯氨酸酶在成骨和破骨平衡中起到重要作用，在多种骨科疾病（如儿童股骨头坏死、骨关节炎、骨质疏松等）中均发生改变^[]。脯氨酸可能在一定程度上提示了股骨头坏死中的骨破坏。与既往研究一致，本研究证实股骨头坏死组织中脯氨酸明显升高，可作为股骨头坏死提示骨破坏的潜在标志物。

在骨的合成过程中，胰岛素样生长因子是一种关键的信号分子，有促进骨形成的作用。L-精氨酸可通过促进胰岛素样生长因子的合成从而刺激成骨细胞修复骨组织，因此具有骨保护作用^[]。林丹和刘毅^[]的研究表明，L-精氨酸在体内和氧分子结合，在一氧化氮合酶的催化下生成一氧化氮，从而促进成骨细胞的分化增殖。中等剂量的L-精氨酸可通过提高一氧化氮而抑制破骨细胞并促进成骨细胞的功能，从而产生骨保护作用。本研究股骨头坏死标本中的L-精氨酸明显升高，可能原因是在股骨头坏死病程中，机体反应性地分泌L-精氨酸激活了成骨细胞以修复坏死的骨组织。因此，L-精氨酸可能提示股骨头坏死中的骨修复。

股骨头坏死病理的中心环节是血供中断导致的股骨头缺血、缺氧，使碳水化合物代谢发生改变。在不同的细胞中，谷氨酰胺均参与碳水化合物的代谢^[]，因此其改变可能提示股骨头缺血、缺氧。谷氨酰胺参与蛋白质合成和核酸代谢。在间质干细胞中，较低浓度的谷氨酰胺能维持细胞的分化潜能和活力^[]。另外，有学者认为谷氨酰胺不仅是一种能量来源，而且还是一种蛋白翻译变阻器。WNT信号通路，通过减少谷氨酰胺浓度，刺激氨基酸的补充和蛋白质合成。在小鼠模型中，谷氨酰胺的降解过程能够介导骨组织的合成代谢^[]。在本研究中，股骨头坏死组织内谷氨酰胺显著升高，因此谷氨酰胺可作为预示股骨头坏死中骨组织合成不足的候选标志之一。

三、研究的意义和局限性

本研究通过萃取股骨头坏死的代谢物，用UPLC-MS/MS方法对股骨头坏死组织中的小分子代谢物进行检测。经过OPLS-DA和多个独立样本的Kruskal-Wallis H检验，筛选出了12种有显著差异的代谢物，并初步确定D-精氨酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺三种代谢物可作为股骨头坏死的候选生物标志物，为后续股骨头坏死机制研究及生物标志物确认提供了基础。本研究样本量较小，为使结果更加可靠还需进一步扩大样本量进行分析。

参考文献（略）