追本溯源：单细胞解析小鼠前脑神经发生期间的细胞谱系

前言

中枢神经系统由不同类型的神经元和神经胶质细胞组成，它们在形态学、生理学和分子marker方面差异巨大。区分成熟神经元亚型的转录特征往往在细胞周期后出现，并在产后发育过程中逐渐变得清晰。而在有丝分裂阶段，目前尚未确定发育轨迹是由特定的谱系决定，还是在发育后期通过与环境的相互作用而产生变化。

单细胞测序的出现能够帮助研究人员进一步解析组织在发育过程中涉及到的细胞分化关系，目前已广泛应用于小鼠、斑马鱼等模式生物的胚胎发生，但在小鼠前脑的神经发生领域尚未有相关文献报道。因此，本研究通过scRNA-seq结合STICR平行标记，重建了前脑神经发生期间的谱系关系，并期待借此结果来更好地解释神经发育障碍。

研究方法

为了确定小鼠前脑中不同细胞类型的发育谱系，研究人员采用了一种STICR的慢病毒示踪的方法（用于识别细胞克隆关系的scRNA-seq兼容示踪剂），它可以使用编码合成寡核苷酸序列（谱系条形码）的慢病毒库对单个细胞进行高通量标记。在E10.5（STICR^E10）、E12.5（STICR^E12）、E13.5（STICR^E13）、E14.5（STICR^E14）时将STICR标签库通过子宫内注射引入胚胎的侧脑室，从而对有丝分裂祖细胞，以及皮层，基底神经节，海马体和嗅球（OB）的子细胞进行标记。等到小鼠的出生后阶段，标记的细胞分化成成熟细胞类型，然后解离前脑组织，通过eGFP表达来富集病毒感染的细胞进行scRNA-seq，对细胞进行溯源分析。

STICR实验流程

基因表达特征和细胞谱系关系

在胚胎发生过程中，不对称分裂的放射状神经胶质细胞和沿心室表面扩增的有丝分裂祖细胞在有丝分裂后，产生神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。从分析结果可以看出STICR^E10、STICR^E14的克隆分布在同样的细胞群中，其中STICR^E10显示少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞（OPCs）之间的耦合更强，而STICR^E14型则显示出这两种细胞类型和星形胶质细胞之间拟合也比较好。相比之下，STICR^E10中标记的有丝分裂祖细胞的克隆可产生多达30个姐妹细胞，远高于STICR^E14中的13个。说明相比于晚期，早期标记的祖细胞能够产生更高比例的克隆分散在多个细胞类别中。

图1 通过单细胞转录组和谱系条形码来确定前脑细胞类别的克隆关系

克隆收敛和发散

为了进一步解析细胞亚型之间的亲缘关系，本研究使用了Visium空间转录组来映射解剖学大脑区域。在之前的9种细胞类型中进一步区分出不同亚群，并通过空间转录组数据反映了不同细胞类型对应的分布区域。例如根据兴奋性和抑制性神经元的marker基因的表达，鉴定了皮质中兴奋性和抑制性神经元群，并量化了它们的克隆关系。与之前研究不一致在于，本文未观察到兴奋性和抑制性皮质神经元具有共同的谱系。

图2 细胞类型的空间转录组映射

为了进一步确定细胞发育的谱系，本研究根据转录组学相似性和谱系耦合相关性分别构建了细胞群间的树状图。可以发现，7个星形胶质细胞亚群在转录上彼此相似，但在谱系树状图上则有不同的分支来源。此外，另一种细胞类型也展示出这种收敛性，OB神经母细胞（4 Inhibitory NP OB Ccnd2）和齿状回神经母细胞（17 Excitatory NP Sox11），在转录组树状图上占据单个分支，但在谱系树状图上则占据相对较远的分支。因此，来自位于不同大脑区域的不同有丝分裂祖细胞的细胞可以收敛到相似的转录组功能上。

而克隆的发散主要体现在抑制性神经元中。研究发现，六个GABA能的投射神经元和大脑皮层下及OB的中间神经元显示出高度的谱系耦合。其中包括纹状体的直接（D1）和间接（D2）多刺投射神经元（SPN，对应细胞群7b、7a），中央扩展杏仁核的投射神经元（群34），杏仁核的ITCs（群8）和OB中间神经元（群2、6）。杏仁核的ITCs与OB的中间神经元和多种GABA能投射神经元类型有关，且D1和D2 SPN都与OB的中间神经元有克隆关系。因此，GABA能神经元的克隆分布在不同的前脑结构中，并且广泛分布在转录多样性的亚型中。GABA能神经元的单个祖细胞可以产生各种不同的GABA能亚型。

图3小鼠前脑的谱系收敛和发散

GABA能神经元的胚胎分化

为了在神经节隆起中特异性地标记有丝分裂祖细胞，本研究又使用了一种基于转座子的条形码方法（TrackerSeq），将含有随机核苷酸的DNA序列克隆到eGFP的3′未翻译区域，使其可以通过scRNA-seq检测到。该技术针对E12.5的细胞进行标记，在E16.5时进行流式分选并单细胞测序。

通过将TrackerSeq处理的数据集和之前在E13.5和E15.5的数据集整合分析，从共同的有丝分裂祖细胞库中，有丝分裂后抑制神经元在细胞周期退出后不久出现五种不同的前体状态（i_Six3/Gucy1a3， i_Ebf1/Isl1， i_Phlda1/Isl1， i_Nr2f2 和 i_Nxph1）。使用相关性分析将每个胚胎前体状态的细胞映射到产后STICR数据集的抑制神经元细胞群中，其中来自i_Six3/Gucy1a3的83%的细胞映射到7a D2 SPNs，来自轨迹i_Ebf1/Isl1的89%的细胞映射到7b D1 SPNs，表明产后的转录特征在发育早期即可出现。

本研究进一步探索了克隆相关细胞是否穿越相同或不同的前体状态，发现其中63.6%的克隆的细胞进入了相同的前体状态，但36.4%的克隆在退出细胞周期后不久就分化成不同的前体状态。因此，神经节隆起中的祖细胞可以产生在神经发生高峰期穿越不同发育轨迹的子细胞，表明克隆分化为不同的GABA能前体状态是在有丝分裂祖细胞的水平上开始的，是一个谱系依赖性过程。

图4 新生的GABA能姐妹细胞分化成不同的前体状态

总结

本研究通过单细胞转录组测序和慢病毒谱系示踪的方法来分析有丝分裂祖细胞的分化过程，发现转录上相似的细胞类型可能来自不同的谱系（即收敛），以及转录上不同的细胞类型则会共享克隆关系（即发散）。例如其中的GABA能组细胞，相关克隆不仅分散到不同的大脑区域，而且还分化成具有截然不同的转录组学特征的类型。尽管在神经发生的早期，由于放射状胶质祖细胞进行对称增殖分裂可能会出现一定程度的克隆分化，但主要的克隆分化仍发生在神经发生后期阶段。

通过本研究确定的细胞谱系关系，可以解释为什么某些细胞亚群在发育障碍中受到影响。后续将体细胞突变信息与细胞谱系相结合，有助于进一步揭示神经发育疾病的致病因素。

参考文献

[1]Single-cell delineation of lineage and genetic identity in the mouse brain[J]. Nature.

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