单细胞分析阐明儿童急性B淋巴细胞白血病微小残留病本质及其耐药机理
研究背景
急性淋巴白血病(ALL)是最常见的儿童癌症，而B细胞ALL (B-ALL)占所有病例的85%。尽管化疗显著改善了儿童B-ALL患者的临床治疗效果，但仍有大约10%的病例复发，这是儿童癌症死亡的主要原因。然而，复发的潜在原因和化疗耐药的机制仍不清楚。而微小残留病(Minimal residual disease, MRD)是儿童B-ALL最重要的预后指标，它已经被用来指导治疗强度，并且能证明骨髓移植的正确性。捕获低丰度残留癌细胞是一项重大的技术挑战，阻碍了耐药性分子基础的进一步探索。幸运的是，单细胞组学技术的发展，特别是单细胞RNA测序(scRNA-seq)，为在单细胞分辨率上研究MRD的异质细胞群提供了很大的机会。
实验流程
图1 实验流程示意图
研究结果
1、正常的B细胞分化
通过来自2例健康供体的16,543个CD19−CD34+细胞和20,392个CD19+细胞scRNA-seq数据结果定义了不同分化阶段的B细胞簇，在这些正常细胞的基础上构建了一个分类器，用来预测不同样本中B细胞发育阶段。通过拟时序分析成功构建了典型的B细胞分化轨迹：从造血干细胞（Haematopoietic stem cells, HSC）/淋巴细胞启动的多能祖细胞（Lymphoid-primed multipotent progenitors, LMPP）向activated B的分化。
同时，作者对与scRNA-seq匹配的细胞进行了BCR测序，发现在2例健康供体中BCR的表达水平是非克隆分布的。scBCR-seq的数据分析显示：仅有重链的细胞在preB中比较丰富，而同时有重链和轻链的细胞在分化程度更高的细胞中更丰富（immature B, mature B和activated B）。
细胞周期分析显示，HSC/LMPP、CLP（Common lymphoid progenitor）、proB和preB中超过20%的细胞为s期细胞，而分化程度更高的细胞（preBII, immature B, mature B和activated B）处于S期的细胞少于5%。
最后，作者评估了B细胞分化过程中关键转录因子的表达谱。PAX5的表达从proB期到activated B期显著增加。HOXA9在HSC/LMP期高表达，然后在proB期后表达下降。作者利用这种转录因子和下游靶基因在单细胞水平上的分期特异性表达，构建了分期特异性基因之间的关系网络（图2）。
图2 健康骨髓样本中的B系细胞
2、利用scRNA-seq和scBCR-seq定义白血病细胞
作者招募了4例复发且为高MRD等级(>5%)的B-ALL儿童患者，同时以4例诊断为缓解的患者（MRD<0.01%）作为对照，对分离出的CD19+骨髓细胞进行bulk全外显子测序(WES)和全转录组RNA测序。结果显示，4例复发患者(B265、B590、B069和B887)具有明显的突变和融合基因。
使用scRNA-seq和scBCR-seq从4例复发的B-ALL儿童患者样本中获得了104,055个CD19+细胞，他们取自于三个阶段(诊断阶段、化疗/诱导治疗后第19天（D19）和复发阶段)。通过对比诊断阶段的scBCR-seq数据，发现四分之三(B887、B590和B069)的患者体内白血病细胞（即恶性B淋巴细胞）表达BCR是缺乏的。这一发现表明，V(D)J重排可能受到干扰，这些患者体内的白血病细胞不能完全表达BCR。
在D19的4例高MDR患者中，非克隆BCR表达的CD19+细胞聚集在一起，表明这些细胞非白血病细胞，倾向于正常的B细胞状态。D19时，患者B590出现MLL-ENL重排，患者B069出现KRAS突变。对B590患者的scRNA-seq和scBCR-seq数据进行整合分析发现：由非克隆BCR表达簇表达了高水平的CD20。肿瘤特异性MLL-ENL融合基因在该患者的CD19+CD20−细胞中特异性表达，而在CD19+CD20+细胞中不表达。这一结果证实了非克隆BCR表达的B细胞簇非白血病细胞。
全外显子组测序显示，患者B069在D19和复发时有KRAS c.35G > T (p.12G >v)突变。而scRNA-seq结果显示缺乏BCR表达的细胞可检测到KRAS突变，这直接证实它们为白血病细胞。因此，这种突变被认为是另一种可以用来区分白血病和非白血病B细胞的标记。
于是作者又构建了一种根据全基因组表达模式来区分白血病细胞和正常B细胞的分类器。建立的分类器在包括健康细胞、诊断阶段和复发阶段的白血病细胞集合上进行了测试，结果表明分类器的性能很好（图3a-h）。
图3 B-ALL样本分选的CD19+细胞中白血病细胞的鉴定和特征
3、诊断阶段白血病细胞的单细胞特性
将上述白血病细胞分类器应用于8例B-ALL患者诊断阶段的细胞分析。大多数诊断阶段的检测细胞被归类为白血病细胞，这表明白血病细胞一直存在基因表达失调模式。基于该分类器，作者重新标记了所有健康供体和B-ALL患者诊断阶段样本细胞，通过比较白血病细胞和非白血病细胞的基因表达谱发现，基因FLT3在白血病细胞中持续上调(2.3倍)（图3i-k）。
4、白血病细胞在诊断阶段和复发阶段的比较
使用白血病细胞分类器来区分白血病细胞和非白血病细胞，并使用B细胞分化阶段分类器来确定白血病细胞的分化阶段。作者发现在所有4例复发患者中，细胞组成向早期分化阶段转移，而细胞周期没有统一的变化趋势。在匹配的4例MRD患者的诊断和复发样本中鉴定出698个差异表达基因，其中379个上调，319个下调。对这些差异表达基因的癌症标志分析显示，在复发的样本中，活性氧途径、各种MYC靶标和G2-M检查点成分显著上调。其中，CDKN1A在每个患者的复发样本中都是最常见的上调基因之一。为了进一步验证CDKN1A上调的功能，在B-ALL细胞系REH和RS4;11中过表达了CDKN1A，结果表明CDKN1A过表达显著诱导化疗耐药。另一方面，CDKN1A基因敲低可使B-ALL细胞(REH和RS4;11)对化疗药物道诺霉素和阿糖孢苷敏感。P21(CDKN1A)抑制剂UC2288被证明能协同使B-ALL细胞系对化疗敏感，UC2288与化疗药物在体外联合应用后，具有显著的剂量-反应效应，协同评分高，细胞凋亡显著增加(图4)。
图4 配对诊断性和复发性白血病细胞的单细胞分析
5、残留细胞缺氧途径的激活
每个患者诊断阶段、D19和复发阶段的细胞分别聚集在一起，几乎没有重叠。为了排除这一结果是由scRNA-seq批量效应引起的可能性，以1:1:1的比例为每个患者手动混合三个阶段的细胞，并将该混合样本作为额外的scRNA-seq文库进行测序。UMAP显示混合样本中的细胞仍然按不同阶段聚类，这证实了细胞分布结果反映真实的生物学差异。
化疗后，更高分化程度的白血病细胞占比增高。然而，在B265患者中，proB细胞亚群占比升高，在B590患者中，HSC/LMPP亚群的占比增加，说明细胞对化疗反应的复杂性。细胞周期分析显示G0/G1期在D19主要表现为停滞趋势，但在4例患者中，有3例在复发期打破了G0/G1期的停滞趋势。
差异表达基因的通路富集分析显示，缺氧通路在强化化疗期间显著上调，在4例患者中有3例患者缺氧信号通路显著富集。为了进一步探索生理环境下缺氧通路的功能激活，建立了B-ALL PDX小鼠MRD模型。与单独用药相比，阿糖孢苷联合HIF1α抑制剂PX478用药组的小鼠外周血中白血病负担增加的速度显著降低，寿命显著延长。这些结果强烈表明，缺氧途径激活可能是化疗难治性B-ALL患者残留白血病细胞的普遍治疗靶点(图5)。
图5 B-ALL在诊断、D19和复发时间点的动态演变
6、具有MLL重排的B-ALL特性
2例患者(B590和B998)为MLL融合突变(分别为MLL–ENL和MLL–AF9)。这2例MLL重排(MLL-r)患者诊断阶段的白血病细胞与其他患者表现出不同的表达模式。他们显著上调的基因包括典型的MLL融合相关基因，如HOXA5、HOXA7、HOXA9和MEIS1。同时还有IGF-结合蛋白质IGFBP7和IGF2BP2、转录因子RUNX2、免疫检查点蛋白CD44和CD96以及谷氨酰胺合成酶GLUL在MLL-r细胞中特异性上调。而CD37和TCF4在MLL-r细胞中显著下调。在2例MLL-r患者中，缺氧途径也被高度激活。scRNA-seq和Bulk RNA-seq数据中发现的关键基因表达的相似性也支持上述结果（图6）。
图6 MLL-r B-ALL的单细胞转录组特征
结论
本研究利用匹配的BCR测序与单细胞转录组分析来解码B-ALL的分子畸变。构建了强大的B细胞分化阶段分类器和白血病细胞分类器，以单细胞分辨率进行B-ALL白血病细胞识别，以确定克隆架构，并从诊断阶段、治疗后直至复发阶段纵向跟踪残留细胞的进展。作者认为缺氧信号通路的激活可能是一个有价值的治疗MRD的靶点。本研究提供了对MRD细胞转录组特征的深入了解，但分析方法也可以应用于探索其他血液系统恶性肿瘤和实体瘤的动态单细胞转录组数据。
参考文献
1. van Galen, P . et al. Single-cell RNA-seq reveals AMl hierarchies relevant to disease progression and immunity. Cell 176, 1265–1281 (2019).
2. Witkowski, M. T. et al. Extensive remodeling of the immune microenvironment in B cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Cell 37, 867–882 (2020).