【研究速览】基于芯片合成的寡核苷酸成功构建抗体突变文库
体外展示筛选人工抗体库已被证明是一个用于发现在临床应用上有价值抗体的方法。对于构建抗体亲和力成熟文库，一个流行的策略是针对靶向决定簇互补区（CDRs）进行靶向突变。最近的一项研究表明，采用联川生物µParaflo®芯片技术，可以快速且低成本的构建一个大规模的复杂CDR片段文库（含有数百万条人工设计的指定序列），为生产用于噬菌体展示筛选癌症抗原靶点的人源化抗体提供了有用材料。
一个国际研究团队，成员来自中国科技大学，美国休斯敦大学和LC Sciences（联川生物美国母公司），构建了多个微扰突变文库（SPM），在转化入大肠杆菌细胞之前，经过了多次迭代CDR区域分类、文库合成、深度测序和质量分析。该团队实施的策略非常重要，因为他们提供了一个非常好的SPM文库设计的实验模型，使用该模型研究人员可以在未来进行与此类似的基于芯片合成寡核苷酸混合物的应用。
Fig. 1. Strategy for designing, constructing and validating SPM libraries.
在设计的初始阶段，研究小组试图开发一个有效分散的CDRs突变文库，不会超出当前的展示系统能力。因为较大的文库具有更高的选择偏好性，一些更容易被展示或者会令其所在的宿主细胞生长更快的突变会优先被选择出来。另一个同样重要的点是，研究小组希望在引入突变时，在不限制获得阳性突变机会的同时，降低文库的理论库容大小。要做到这一点，研究人员首先基于抗体典型结构将他们的抗体库分为不同的组。通过分析抗体CDRs中的氨基酸偏好，他们能够集中精力在那些更可能影响亲和力的突变位点上。然后使用定制的简并密码子，将经过系统化分析的氨基酸残基突变引入到有限数目的更偏好突变的CDR位点上。该策略使得研究小组只需要合成数百条简并寡核苷酸，就能得到一个具有数以万计特异的核苷酸序列的SPM文库。
为确保SPM文库均匀地覆盖所需的氨基酸序列，研究团队遵循一个优化和改进文库合成的简单方法。具体地说，他们采用新一代测序（NGS）技术评估基于设计输入的核苷亚磷酰胺单体比例所得到的输出核苷酸的偏好性。
在第一个SPM库（v1）合成后，使用深度测序确定每个简并寡核苷酸的平均序列拷贝数。研究小组观察到每个简并寡核苷酸亚库内的平均序列拷贝数和该亚库内总核苷酸序列数量之间呈负相关。这些结果证实了无论在简并寡核苷酸亚库内引入多少条特异的寡核苷酸序列，每个微芯片室合成了几乎等摩尔量的单链DNA。于是研究人员重新对合成小室进行了安排规划，使得可以得到更加有效和平衡的序列丰度以及更低的拷贝序列偏差，并以此方式合成了v2和v3文库。在v1库中随着核苷酸序列的平均拷贝数下降，亚库的大小增加了，而由于调整了合成方法，在v2和v3文库中，核苷酸序列的平均拷贝数通常独立于亚库的大小。
Fig. 2. Statistic analysis of ambiguous nucleotides in the v1, v2, and v3 libraries.
研究小组进一步提出了一个简单的构建单链抗体片段噬菌体文库的方法，通过对双链质粒进行一步法突变PCR来完成文库的构建。此策略应用于chA21，一个工程化的肿瘤抑制相关的抗ErbB2抗体。研究人员创建了六个SPM文库，分别对应每个chA21 CDR，每个文库中都引入了单残基和双残基突变。在富集结合抗原的scFv突变体后，通过反复筛选结合生物素化的ErbB2的重组噬菌体，噬菌体ELISA表明在所有文库中大部分的CDR突变体都显示出提高的亲和力。最后，研究小组从4个CDRs中找到一个带有组合突变的scFv突变体，在亲和力水平上提高了19倍。
这是第一次，研究人员证明了微流体芯片通过编程，可以同时合成成百上千的高度复杂的简并寡核苷酸，这些寡核苷酸适用于构建多种抗体CDR文库。在芯片上合成简并寡核苷酸的成本，显著低于传统的基于柱的DNA合成。通过全面地分析芯片合成的寡核苷酸的质量，NGS技术证实了各反应室可以独立地指定合成一种简并寡核苷酸，含有数千个特异的核苷酸序列，而来自每个反应室的单链DNA的总摩尔量是保持不变的。
本项目的寡核苷酸合成是基于联川生物µParaflo®芯片技术。
参考文献：
1. Xu M, Hu S, DingB, Fei C, Wan W, Hu D, Du R, Zhou X, Hong J, Liu H, Gao X, Liu J. (2015) Designand construction of small perturbation mutagenesis libraries for antibodyaffinity maturation using massive microchip-synthesized oligonucleotides. J Biotechnol 194:27-36.