引物选得好，测序没烦恼！｜微生物
“微生物组”（Microbiome）是指由多种微生物聚居在一起形成的生态群落，从人和动物的肠道，到植物、土壤、海洋，它们无处不在，推动着地球物质循环，影响着人体乃至整个地球生物圈的健康。
近年来，得益于低成本高通量基因测序技术的发展、计算和成像技术的改进，以及用于数据分析的生物信息学工具的革新等进展，高通量测序走下神坛，变得平易近人，使得更多的学科领域开始投入到微生物组学的研究中来。
对于微生物组学的研究，最常见的就是对微生物群落结构多样性的研究。也就是通过二代测序技术对16S rDNA/18S rDNA/ITS等序列进行测序，获得样品中的微生物群落组成以及相对丰度。探讨微生物多样性对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。
那么问题来了
你真正了解16S测序吗？
为什么选择16S测序？
16S测序区域又该如何选择？
今天，我们就来聊聊16S测序中的引物选择。
首先要了解一下16S是个啥？
详情在之前的16S专题中详细说过，16S是一段序列，是原核微生物的“身份证”，你拿到这段序列，再跟数据库一比对，所有的物种信息你就完全明了了。因为操作简单，可行性高，比对信息准确，所以被认为是微生物多样性组学研究中最常用的检测手段。
16S说完了，再来了解一下16S测序区域是个啥？
16S rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16S rDNA就是编码该亚基的基因。16S rDNA基因全长1542 bp，由9个可变区（V1-V9）和10个保守区组成。不同种类的细菌有相同的保守区序列和不同的可变区序列，因此可以根据保守区序列设计引物来扩增环境样品中所有细菌16S rRNA基因，而根据可变区序列来区分不同种类的细菌。
图1 16S rDNA基因组成（绿色为可变区）
传统方法中最常用的引物是27F和1492R，几乎能扩增出完整的16S rRNA基因全长，由于目前二代高通量测序的读长限制，该引物不适用于高通量测序平台，但被广泛用于纯菌的分子鉴定。考虑到目前主流高通量测序平台读长的限制，只能对16S rDNA的某一段可变区进行测序。有文献中选择测单V区（V3/V4/V6），有的测双V区（V3-V4区或V4-V5区），还有的选择三V区（V1-V3区、V5-V7区或V7-V9区）进行16S rDNA测序。
那么问题又来了，到底选啥才能测的稳准狠啊？！
别急，且听小编慢慢道来~
想测的准，毫无疑问当然长度越长越准确嘛，但是出于经济实惠的角度考虑，其实测双V甚至单V区已经足够。一般而言，环境微生物组学常用的，也是认可度比较高的测序区域是V3-V4，V4-V5，或者单测V4区。
那不同的测序区域对数据结果有什么影响呢？
先来看看中科院周宁一老师于2013年发表在AEM杂志的一篇文章（IntragenomicHeterogeneity of 16S rRNA Genes Causes Overestimation of Prokaryotic Diversity），研究比较了16S不同区域的测序结果，所选择的引物如下：
研究结果显示，V4-V5区域是最佳的测序区域，造成的基因组内异质性最小。
也就是说一般会选择常用的V4-V5区，引物515F/907R 或者515F/926R。这也是罗氏454测序时代最常用的16S测序引物。
在Illumina时代，由于平台测序长度的限制，V4单区测序（515F/806R）被更为广泛地使用。也是地球微生物计划中推荐使用的引物序列（想了解地球微生物组戳这里：http://www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/16s/）。
图2 地球微生物组计划中使用的16S测序引物
传统的V4区引物，由Caporaso等科学家(2012)设计，对细菌的覆盖度高，也可以同时检测到部分古菌。然而随时数据库的日益更新，我们发现这对引物虽好，但还是有改善空间的。既然可以细菌古菌通测，那我们能不能改进一下，让古菌覆盖的更广泛一些。
转眼到了2015年，Parada等科学家发现，传统的V4区引物（515F/806R），会对海洋中SAR11群落的检测造成低估，同时对γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）造成高估，因此他们对传统V4区引物的515F的一个兼并碱基做了改进，并结合926R引物，对海洋中的微生物多样性进行了检测，发现改进后的515F引物可以有效地改善扩增偏好性。
秉承着追求科（wu）学（mei）严（jia）谨（lian）的目标，越来越多的科学家想要在有限的经费内获得更多覆盖面更全的序列信息，于是Apprill等科学家在515F改善的基础上，进一步改善了806R端（嗯，也是只改了一个兼并碱基而已），相比原先的806R端其覆盖面更广了。他们推销的口号是“我的片段虽然短！花钱更少测的好！”
好吧，Caporaso眼看自己辛苦设计出来的引物都被改进了，虽然改的好，但直接说出来岂不是太没面子了。于是2016年，几个相关科学家联手发表了一篇文章（Walters et al. 2016），使用不同的环境样品对这几对引物进行了比较。最后研究证明，改进后的V4区引物（515F/806R）确实效果不错，相比之前，不仅对细菌群落的检测进行了矫正，还可以多测出来好多古菌，一举两得！
注：上表是改进前后引物序列的详细信息，改进的碱基用黑体加粗了。
此文发表后，地球微生物组计划也与时俱进的把这两对改进后的引物列在了自己的网站，希望更多的环境微生物组学科学家可以来规范使用引物，方便进行不同环境的研究对比。截止目前，短短不到一年时间内，谷歌学术检索到引用改进后V4区引物（515F/806R）的文献已有8篇，其中包括一篇Cell（Sampson et al. 2016）和一篇Nature Microbiology（Snijderset al. 2016）。
图3 截图示例地球微生物组计划改进后的16S测序引物
因此对于环境样本而言，使用改进后的V4区引物（515F/806R）及515F/926R，可能在行业标准日益规范的今天，是一个更好地选择，今后应该会成为16S检测微生物多样性测序的首选。
简而言之，V4单区测序（改进后的515F/806R引物）将是16S测序的主力~
那么最重要的问题来了！！！
这么好用的引物，联川作为业内领先的微生物组学研究服务商，收入了吗？
这还用说，早已收入囊中~
现在起，您就可以使用联川16S rDNA V4区的微生物群落多样性分析啦~
实验周期缩短
测序深度扩大
引物扩增偏好性得到改善
检测结果覆盖面更广
够不够~
这些就是吸引你来理由~
本文整理自微生物生态
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