想提高qPCR验证吻合率，转录组测序这样做就对了
qPCR验证的基因换了一批又一批，但是与转录组测序结果吻合的寥寥，原因我们总结在这里 ↓↓↓
来自测序文库PCR扩增产生的Duplication，是一个常被大家忽略，然而却是干扰定量分析准确性的最主要原因之一。因为定量结果不准确，自然地会导致qPCR验证吻合率低。
这个问题怎么破，应对的策略其实很简单， “PCR扩增重复避不开，那就来打上标记。” ↓↓↓
联川生物重磅推出采用UMI（Unique Molecular Identifier）标记技术[1,2,3]，为追求真实结果的科研人量身打造——绝对定量转录组测序。新方案不仅真实反映样本中的基因表达水平，还真实反映样本中的转录本序列组成。
在绝对定量转录组测序方案中，每条序列都会被unique的UMI标记，计算序列拷贝数时，不再像传统那样统计同一种reads的总数量，而是统计每种reads有多少个unique的UMI。具有相同UMI的同一种reads，无论有多少拷贝数，都只计作一个拷贝，即来自PCR扩增的假重复（Duplication）被有效去除，真实反映样本中原始的基因表达水平（见图1）。
图1 UMI绝对定量转录组测序vs常规转录组测序
由于Duplication的存在，在没有UMI标记的情况下，3种序列片段经PCR扩增，拷贝数分别变为4，9，6，已偏离它们原始的拷贝数；而标记了UMI的3种序列片段，合并具有相同UMI的同种序列后，3种序列片段的拷贝数与原始拷贝数保持一致。
在文库PCR扩增和测序过程中难免会引入错误的碱基，具有相同UMI标记的序列可以基于多序列比对来纠正PCR扩增和测序过程中引入的错误，确保获得转录本的真实序列（见图2）。准确的序列组成是研究者进行可靠的序列基因组比对，转录组组装，以及可信的基因可变剪接、RNA编辑分析的基础。
图2 UMI标记技术纠正序列错误
联川生物采用UMI技术的绝对定量转录组测序方案，助力研究者获取真实的转录组定量结果，进而获得更高的qPCR验证吻合率，大幅减轻验证实验工作，最后快人一步地取得科研成果。
了解绝对定量转录组测序详情，请微信留言或拨打0571-87662413。
1. Shiroguchi K, et al. Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-molecule barcodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jan 24;109(4):1347-52.
2. Kivioja T, et al. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods. 2011, 9(1):72-4.
3. Saiful Islam, et al. Quantitative single-cell RNA-seq with unique molecular identifiers. Nature Methods 2014, 11:163-166.