PNAS文章是怎么说绝对定量转录组测序的？|低拷贝定量
往期内容回顾
本期来细说UMI标签定量复杂度远胜spike-in的转录组表现如何。
结果
3.数字化定量大肠杆菌转录组
作者从标签标记的cDNA文库中获得了2600~3200万个能够特异比对到E.coli基因组的reads（实验设置为2次重复）。图4A显示了fumA转录单元的常规计数和数字化计数（使用unique标签）的数量是核苷酸位置的函数。并不意外，常规计数整个转录单元的read密度远低于数字化计数的数量均一性，这可能是因为片段扩增的固有噪音和偏好造成的。
图4 数字化定量大肠杆菌转录组
在实验中，大肠杆菌转录本均匀地采样所有标签是至关重要的。图4B显示了这种分布接近泊松分布，但有些分散。这种偏好的采样减少了可用有效标签序列的数量(Neff)。然而，在大肠杆菌转录组样本中，两种计数方法中最丰富的cDNA拷贝数介于10到40个拷贝。基于泊松统计，即使对于样本中最丰富的cDNA片段，只要Neff达到约100-400即可unique标记95%的分子。因为有21,025个标签对可用，平均而言，图4B中观察到的随机性程度就足够的。
常规方法计算扩增子的数量，是受到偏好和固有扩增噪音干扰的数量，而不是原始样本中的分子数量。相反地，在数字化计数方案中，unique标签序列会区分样品中的每个分子，因此可以最小化固有噪音的影响。图4C表示在低拷贝数定量时，常规计数分布超过了3个数量级，显示出与数字化计数的巨大差异，表明使用unique标签的数字化计数更有优势。而两者在高拷贝片段定量时具有较强的相关性，在定量整个转录单元和基因也观察到了相同的现象。
为证明数字化计数优越的准确性，作者考察了单个转录本内丰度测定的均一性。由于总体上单个转录单元是RNA合成后的完整分子，比对到给定转录单元的某个区域的cDNA片段应该与比对到同一转录单元的不同区域的片段具有相同的丰度。采用直方图对不同丰度区域的转录单元分析常规计数的变异vC和数字化计数的变异vD之间的比率（见图4D）。具体分析方法这里不展开。分析结果是，平均而言，数字化计数在定量准确性方面优于常规计数，其性能优势对于低丰度转录单元尤为明显。
图4显示数字化计数比常规计数具有更少噪音也更准确，图5显示数字化计数也具有更优的重复性。作者在图5A中的单个转录单元的水平上证明了这一点，它显示了fumA转录本的常规计数和数字化计数的两个重复之间的计数比率。这个比率对于数字化计数来说始终接近于1，但是对于常规计数来说是在三个数量级上波动。作者在图5B和C中分别分析了用常规计数和数字化计数定量转录单元和基因的全局重复性。在这两种情况下，数字化计数的重复之间的相关性都明显好于常规计数，特别是对于低拷贝转录本。
图5 数字化定量和常规定量大肠杆菌转录组的重复性比较
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