植物phasiRNA研究进展（二）

植物phasiRNA (phased, secondary, small interfering RNA) 是一类内源性的、起调控作用的非编码小RNA (sRNA)，它在植物的生长、发育、生殖以及抗病中发挥着重要作用。PhasiRNA 初级转录本由Pol II(RNA polymerase II) 转录，随后miRNA (microRNA) 引导AGO 蛋白对phasiRNA 初级转录本上的靶位点进行剪切，剪切后的phasiRNA 前体片段( 剪切位点的上游或下游片段) 继而被RDR6 (RNA-dependent RNA polymerases 6) 复制成双链RNA，双链RNA 被DCL4 切割成一系列首尾相接，具有一定相位的21-nt 或24-nt的小RNA，即phasiRNA。成熟的phasiRNA 与AGO 蛋白组装成沉默复合体，作用于靶基因，发挥转录后调控的功能。本文对植物phasiRNA 的生物合成通路、生物学功能及其进化进行综述。

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植物phasiRNA的生物合成途径

PhasiRNA 是一类特殊的siRNA，它既可以顺式调控其来源基因，又能够反式作用于其他基因，由miRNA介导AGO蛋白剪切产生，且生成的siRNA 具有一定的相位，而它的合成途径有别于其他的siRNA。

1.1　植物中phasiRNA的转录

PhasiRNA 由Pol II 从PHAS 位点转录出初级转录本(primary PHAS transcript, pri-PHAS)，初级转录本拥有5' 帽子(5'cap) 和3' 尾巴(3'ploy(A))( 图1)。PHAS 位点所在的区域可能是基因区，也可能是基因间隔区。研究发现，番茄91个潜在的PHAS 位点中有51 个位于基因区，剩余的位于基因间隔区，而大豆中有208 个PHAS 位点与NBSLRR (nucleotide-binding site, leucine-rich repeat) 基因重合。部分初级转录本拥有多个短的阅读框，虽然它们对于phasiRNA 的生成不是绝对必需的，且还未证实初级转录本的阅读框可以编码有功能的蛋白，但是它们的存在对于维持初级转录本的稳定及成熟phasiRNA 的水平具有一定意义。初级转录本的阅读框还可以通过微调实现对phasiRNA 靶基因表达量的精确调控。

图1 phasiRNAs的合成通路

PhasiRNA由Pol II酶从PHAS位点转录出初级转录本；初级转录本与核糖体结合并被miRNA介导的AGO蛋白切割生成phasiRNA前体(THO/TREX 在此期间将phasiRNA初级转录本从细胞核运转到细胞质中)；在SGS3和SDE5的协助下，RDR6将单链RNA复制成双链RNA；双链RNA被DCL4和DRB4复合体切割成首尾相连的、相位小片段RNA；小片段RNA再被HEN1甲基化；小片段RNA中的一条链与AGO蛋白结合沉默casiRNAs或ta-siRNAs。

1.2　植物中phasiRNA前体的加工

粗面内质网膜上的多聚核糖体(membrane-boundpolysomes, MBPs) 在细胞中主要功能是合成向外分泌的蛋白质或酶，也是加工phasiRNA 前体的部位。PhasiRNA 初级转录本可能被THO/TREX (transcription/export) 复合体从细胞核运转到细胞质，再与粗面内质网膜上的核糖体结合并暴露出产生phasiRNA前体的部分，miRNA 则通过碱基互补配对与phasiRNA 初级转录本上的特定位点结合，并介导AGO 蛋白对其进行剪切生成phasiRNA 前体(pre-phasiRNA)。PhasiRNA 初级转录本与核糖体的结合在一定程度上可以阻止其被降解。

PhasiRNA 的合成需要miRNA 的参与，且只有部分特定长度的miRNA ( 表1、表2、表3) 能够触发phasiRNA 的产生，如22-nt 的miR173 能够触发TAS1 产生ta-siRNA。此外，miRNA 两端的核酸序列也会影响phasiRNA 的合成，miRNA 3'端第20 位核苷酸影响它与phasiRNA 初级转录本的结合, miRNA 5' 端则影响它与相应AGO 蛋白的结合。

21-nt phasiRNA 前体的产生有两种模式，分别为“one-hit”和“two-hit”。

“one-hit” 模式是指phasiRNA初级转录本上只有一个miRNAs 结合位点，22-nt 的5'U miRNA 介导AGO1 剪切phasiRNA 初级转录本并释放3' 端片段进行下一步加工；

“two-hit” 模式则是phasiRNA 初级转录本上有两个miRNA 结合位点，并被相同或不同的21-nt 或22-nt 的miRNA/AGO 复合体识别与结合，因为2个miRNA与phasiRNA初级转录本的匹配度不同，所以，只有完全匹配的3' 端结合位点被剪切，而与5'端位点结合的miRNA 上有一个碱基凸起，因此，该位点不会被剪切。

拟南芥中的TAS1、TAS2和TAS4 基因以“one-hit” 模式产生phasiRNA；而TAS3 初级转录本则由2 个21-nt 的miR390 识别并结合，以典型的“two-hit”模式产生ta-siRNA，且5'端miR390/AGO7 的存在直接影响ta-siRNA 的合成。此外，“two-hit” 模式也可以由2 个22-nt的5'U miRNA 介导，如苜蓿属中，由2 个miR1509同时结合Medtr7g012810 基因的初级转录本介导AGO1 对其剪切，产生phasiRNA 前体。此外，de Felippes 等研究表明，只有一个miR390 的情况下，TAS3 同样可以产生tasiRNA，而“wo-hit”模式则可能是为提高ta-siRNA 产生过程的保真度和下游基因调节的准确性。

PhasiRNA 前体继而在SGS3 (suppressor of gene silencing 3) 和SDE5 (silencing defective 5) 协助下，被RDR6 (RNA-dependent RNA polymerases 6) 复制成双链RNA。然后，与DRB4 (dsRNA-binding protein 4)结合的双链RNA 被DCL4 (Dcer like 4) 切割成首尾相连的短片段RNA，即phsiRNA，在DCL4缺失的情况下，DCL2 和DCL3 将替补DCL4 完成切割工作。短片段RNA 的3' 端再被甲基转移酶HEN1 (HUA ENCHANCER1) 甲基化以降低其降解速率。最后，AGO 蛋白与phasiRNA 中的一条链结合，形成沉默复合体，作用于它的来源基因以及来源基因的同家族基因或切割其他基因的mRNA。

1.3　植物中phasiRNA的动态平衡

成熟的phasiRNA 与AGO 蛋白结合组成沉默复合体(RISC)，调控植物的生长发育。为了维持细胞的稳态，phasiRNA 的降解必须维持在一定的水平，而不同phasiRNA的降解速度是不同的，如葡萄树vviTAS7 位点产生的tasi-RP1a、tasi-RP1b、tasi-RP1c 和tasi-RP1d 中，21-nt 的ta-siRNA 降解速度最慢，而毛果杨中相同转录本上同时生成的各种phasiRNA 的降解速率相差几千倍。此外，phasiRNA初级转录本上miRNA 结合位点附近的基因也会影响phasiRNA 初级转录本的降解。

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（文章转载至已发表文献，原文DOI：10.13376/j.cbls/2018098）