如何理解m6A测序数据？| m6A专题

1什么是m6A？

近几年关于mRNA的内部修饰（internal modification）的研究逐渐增多，包括N6甲基腺苷修饰（m6A，结构见下图）、N1甲基腺苷修饰（m1A）、甲基胞嘧啶修饰（m5C）、假尿苷修饰（Ψ）等。作为mRNA中最常见的甲基化修饰，m6A主要富集在mRNA的启动子区、终止密码子区以及RRACH motif内。一旦参与m6A修饰的酶出现异常会引起一系列疾病，包括肿瘤、神经性疾病、胚胎发育迟缓等。此外，一些非编码RNA如lncRNA、tRNA、rRNA以及剪切体RNA在转录前后，也存在大量的碱基修饰活动。

图1 m6A甲基化修饰和m6Am超甲基化修饰

2m6A甲基化酶（methyltransferase）

m6A这种甲基化修饰被证明是可逆化的，包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等共同参与。甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等，主要作用就是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。其他甲基化转移酶包括ZFP217、RBM15、RBM15B、HAKAI (CBLL1)、ZC3H13，其中ZC3H13被证明可直接调控m6A修饰。去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等，作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。

图2 m6A甲基化加工过程

3如何进行数据筛选及数据挖掘呢？

Tip:对于首次拿到分析结果的老师来说，第一步是阅读结题报告以了解整体项目的分析流程、分析内容解释说明及所在的文件夹位置，以对整个项目有一个初步了解，随后查看完整分析结果并进行数据分析及筛选等。在项目结题报告中已提及的相关说明，在此不再详细描述，本文旨在结题报告的基础上进行补充说明，希望对后续的数据挖掘有所帮助。主要从以下几个层面进行阐述：

①建库测序

采用免疫共沉淀方法，即甲基化RNA特异性抗体与被随机打断的RNA片段进行孵育，抓取有甲基化修饰的片段进行测序；同时需要平行测序一个对照(control)样本，对照样本用于消除抓取带有甲基化片段过程中的背景。提取总RNA后，加入片段化试剂，将完整的mRNA进行片段化。随即将其分为两份，一份加入带有预混好的m6A抗体免疫磁珠，对含有m6A甲基化的mRNA片段进行富集；另一份作为对照，直接构建转录组测序文库（即PolyA抓取+dUTP建库）。采用链特异性建库流程构建测序文库，分别将构建好的2个测序文库进行高通量测序。因此同一个样本会获得2部分测序数据，用于后续的数据分析。

②生物信息分析流程

（1）数据质控；

（2）peak鉴定（peak calling）及diff peak分析：基于m6A-seq（IP，抗体富集后获取的测序数据）和RNA-seq（input）测序数据进行peak鉴定；目前默认p<0.05为diff peak为差异peak筛选阈值。如果您觉得筛选结果还是太多，怎么办呢，您也可以通过“diff.log2.fc”来进一步做数据过滤；

（4）motif分析；

（5）基因定量及差异分析：差异基因表达分析；

（6）diff peak和基因联合分析：可以同时查看diff peak和及其对应基因的表达水平，从而初步判断diff peak及其对应基因的上下调情况。

③生信分析结果

（1）如何进行数据筛选？

大体了解分析流程和分析结果后，小编建议您可先从联合分析结果部分进行感兴趣或候选基因筛选，筛选策略如下：（1）已有候选基因：可直接进行筛选；（2）暂无候选筛选目标时，可以从FC值和P值角度进行后续基因筛选；（3）由于m6A可能调控基因的表达，因此可以从其上下调情况进行筛选，如筛选2者表达趋势相反基因，当然这只是其中一个筛选标准，后续需基于具体筛选目标做相应调整；（4）此外，也可基于文献的筛选策略进行数据挖掘。在实际数据筛选过程中，需基于实际情况不断调整筛选策略，以期尽可能获得满意分析结果，从而对下游实验有所帮助。

（2）如何看Motif分析结果?

RNA甲基化修饰以及去甲基化修饰起始于多种结合蛋白与发生甲基化位点的Motif相结合。Motif本质上是一种具有生物意义的核酸序列模式，这些RNA甲基化相关的酶可识别这些Motif并与之结合，从而影响基因的表达。基因表达调控机制研究是生物学研究的重点内容，鉴定这些motif，对于基因表达调控机制研究具有重要意义。使用Motif分析软件在peak区域寻找可信度较高的motif，得到每个Motif的宽度、E-value、PFM、PSSM以及其在各个peak序列总的位置信息等等。我们针对每组样本以及差异结果进行motif预测。根据P值对预测到的motif进行排序，P值越小，排序越靠前。目前报道较多的motif结构为RRACH（ R代表A或G，H代表A、T、C），后续可基于此进行motif查找。

（3）个性化分析图片绘制

为更好更准确的获得预期的图片效果，建议您直接提供例图及其对应的参考文献，我们的技术工程师将尽快给出反馈并进行个性化图片绘制。

Tip:目前只是基于一些共性问题进行整理，后续将陆续更新一些常见问题以更好的服务各位的科学研究。

4参考文献

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Jia G, Fu Y, Zhao X, Dai Q, Zheng G, et al. (2011) N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature Chemical Biology 7: 885-887.

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