硬干货！！关于phasiRNA分析，你需要了解这些概念 | miRNA专题

phasiRNA作为小RNA的一员，广泛存在于各类植物以及它们的各种组织中，在物种进化、植物生长发育、响应生物和非生物胁迫中都扮演着重要的角色。

PhasiRNA初级转录本由Pol II (RNA polymerase II) 转录，随后miRNA (microRNA) 引导AGO 蛋白对phasiRNA初级转录本上的靶位点进行剪切，剪切后的phasiRNA 前体片段( 剪切位点的上游或下游片段) 继而被RDR6 (RNA-dependent RNApolymerases 6) 复制成双链RNA，双链RNA被DCL4切割成一系列首尾相接，具有一定相位的21-nt 或24-nt的小RNA，即phasiRNA。成熟的phasiRNA与AGO蛋白组装成沉默复合体，作用于靶基因，发挥转录后调控的功能（图1）。因此研究植物中众多phasiRNA 的合成通路以及它们调控靶基因表达的机制，有助于我们深入了解植物生长发育的调控网络。

图1：phasiRNAs的合成通路

联川生物phasiRNA的整个分析流程如图2所示。采用PhaseTank分析软件，能够系统、快捷地鉴定出phasiRNA，首先将测序数据比对到参考基因组上，过滤掉已注释为其他RNA 的序列，其次计算转录本的RSRP值，并取前5%的序列进行下游预测，然后确定phased cluster，进入计算phased得分系统，最后通过Cleave Land4软件进行预测 phased-triggered miRNAs或者phasi RNAs的靶基因，得到miRNA→TAS→tasi RNA→target genes这样的调控盒子，最终将整个phasiRNAs参与的复杂的调控体系描述出来。

图2：phasiRNA分析流程

这里我们引入一个全新的概念RSRP（相对 small RNA 产量）：相较于平均水平该位点产生small RNA的能力。

计算公式：

N 为输入转录本的总数目

对于潜在可以产生 phasiRNA 的转录本，我们采取Axtell（2010）的方法来寻找 phased 位点，判定哪些位置产生phasiRNAs的可能性最大。

（1）将small RNA reads利用bowtie比对到整个参考序列上，记录能匹配上的 reads对应的位置，正负链，转录本名称和转录本染色体位置等信息；

（2）将所有匹配到负链的reads的位置匹配信息统一修正到正链对应的位置，因为有2nt的悬垂，所以所有匹配到负链的reads的位置信息通过加上2来修正到正链；

（3）将转录本上的每个位点如图3依次排入 21 个 bin 中(1→bin1, 2→bin2…21→bin21; 22→bin1, 23→bin2…42→bin21…)，直到该转录本最后一个核苷酸位置；

（4）这样对于每一个转录本的所有位置都分配给 bin1-21,那么根据上面步骤（1）中reads 匹配的信息，可以找到匹配到每个bin位置的所有reads的丰度，将所有的丰度值相加得到该bin位置的总丰度。对于21个bin 位置，有21个丰度值，按从大到小依次排列后，取丰度最大 bin位置对应的转录本上的位点，作为该转录本上phased siRNA的产生位点。

图3：bin位置分配方法

结合PHAS基因的独特生成和作用方式，Fahlgren等人提出的 small RNA cluster 的概念(Fahlgren, Howell, et al. 2007; Zhang, Li et al.  2012)，引入了 phased siRNAs  cluster的概念，在cDNA前体上寻找产生phasi RNAs的cluster区域是通过phased位点reads匹配情况来决定的（图4）。它们之间需满足以下几个条件：

（1）因为该reads群是间隔21bp倍数的reads，根据他们匹配的位置从小到大排列为：P₁，P₂，P₃…P_n；

（2）如果P_i – P_i-1 <= 84，且为连续4个reads以上，则将该转录本上满足该条件的最大连续 reads 区段作为 phasiRNAs cluster。

4：phased siRNA cluster的定义

Phased abundance、Phased ratio和Phased number这三个参数也非常重要，为phased score三大贡献因子，能使得结果更加准确。

Phased abundance：匹配到phased位点的reads总丰度。

Phased ratio：匹配到phased位点的reads丰度与匹配到该cluster上的所有reads丰度之比，也就是phased位点reads对整个phased cluster reads总丰度的贡献。

Phased number：匹配到 phased 位点的reads的个数。

参考文献：

Axtell, M J 2010. A method to discover phased siRNA loci. Methods Mol Biol 592: 59-70.

Fahlgren, N, M D Howell, K D Kasschau, E J Chapman, C. M Sullivan, J S Cumbie, S A Givan, T F Law, S R Grant, J L Dang, J C Carrington. 2007. High-throughput sequencing of Arabidopsis microRNAs: evidence for frequent birth and death of MIRNA genes. PLoS One 2(2): e219.郭清利. 基于高通量测序数据的黄瓜Small RNA识别和PhaseTank软件开发[D]. 西北农林科技大学,2014.朱成新,熊伟,莫蓓莘.植物中phasiRNA研究进展[J].生命科学,2018,30(08):831-839.

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