肠道菌群多样性测序做多少次重复？检测16S双区还是单区？

图1 肠道微生物处于多种疾病的交叉点

肠道菌群研究有多热，请现在就打开Pubmed搜搜“gut microbiota”。2018年20分以上的文章多达47篇，今年到现在已发表13篇。肠道菌群与人类健康维持，与各种疾病发生发展的紧密关系已不必多说（图1）。要获得可靠的肠道菌群多样性分析结果，多做样本重复是必需的。那么做多少次重复才合适？还有个绕不过的问题，多样性检测16S哪个区更合适？

关于样本重复数，通常要考虑统计学分析（要做差异分析必须得有重复），生物学合理性（细菌种类繁杂，采样误差，个体差异等等，重复做少了结果不可信），以及成本考量（16S价格亲民，多做样本可以降低非人为因素的干扰）等因素。关于16S rDNA检测哪个区，有建议双区的（如V3-V4），也有建议单区的（如V4），哪个区更合适呢。

我们结合多项肠道菌群队列研究数据和开展项目的经验再和大家说说这两个问题。

下表收集整理了从2018年至今的全部16篇肠道菌群多样性队列研究的一区文章中的数据。我们来从这些研究数据中找找趋势和答案。

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在这16项队列研究中，13项（81%）研究中至少有一组样本重复数>50例，最多一组为996例，最少一组为12例。结合我们的项目经验和数据，以人为对象，样本重复次数≥30是需要的（除去样本不易获得的情况），50例以上是趋势。

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另外3项研究，除1项以人为对象外，另外2项分别以猕猴和小鼠为对象，至少有一组样本重复数≥5例。以动物为对象，样本重复次数≥5是需要的，8到10次重复得到的实验数据更好。

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样本数量多少虽不完全决定文章影响因子的高低，但是更多的样本数量有助于发表高分文章，样本数量最多的前四项研究的文章影响因子均＞10。除3项以人为对象的研究外，样本总数在200例及以下的，影响因子均＜10。结合我们的项目数据，同等实验内容，样本数量多的，对文章是加分的。样本数较少，需要增加其他维度的组学数据，才更有可能发高分文章，对研究者的要求也更高。上述3项样本数量相对少的研究，除肠道菌群多样性数据外，还联合了如宿主基因分型数据（基因组SNP），肠道菌群代谢组等数据，来丰富研究内容，提升文章档次。

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从这16项研究看，16S的单区（如V4）和双区（如V3-V4）都是菌群多样性检测的核心可变区，已被广泛认可。进一步来看数据，选择双区的研究要少于单区（6 : 9）。双区的选择较多样，并不统一，其中V1-V2（3项），V3-V4（2项），V4-V5（1项）；相较之下，大家对单区的选择比较一致，全部为V4，并且样本数量最多的前四项研究均检测V4。注意到，检测单区或双区与文章影响因子的高低并没有明显的相关性。这个情况与我们的项目经验是一致的，相较于选择哪个区，样本数量的多少更影响实验结果。

总结

综合起来，做人肠道菌群多样性检测，样本重复次数通常不应少于30次，建议50次以上。选择16S双区还是单区检测，不会给文章加分，不用纠结。提升文章档次，多做些样本是一个简单又高效的方法。

获取16项肠道菌群多样性队列研究全文，请回复后台“肠道菌群”。

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