miRNA异构体（isomiRs）与靶向识别新机制 | miRNA专题

miRNA是长度22nt左右的小RNA，在个体生长发育和疾病发展中发挥重要作用。传统观点认为，在动物中miRNA靶向mRNA依赖于miRNA的种子区域（seed region，2-7nt）与mRNA 3'非翻译区（Untranslated Regions, UTR）的碱基互补配对，在不减少mRNA数量的情况下达到抑制mRNA翻译蛋白的功能。最为常规的研究即是围绕这些miRBase收录的经典miRNA及其调控机制进行的。然而，近年来的研究结果提出了一些新的看法。

一IsomiRs简介

首先，随着高通量测序技术的发展，早期认为的miRNA loci仅产生1条miRNA成熟体序列这一观点被颠覆。对于某一miRNA来说，它并不是单一的序列，而是由一系列长度/序列及表达不同的异构体（isomiRs）组成。这些isomiRs表达多样且序列多样，甚至引入多样的5'端及种子区域。特定miRNA位点在疾病组织中可具有异常的表达模式，现已证实，部分isomiRs具有重要的生物学功能。

1. IsomiRs的产生

前人已对miRNA的产生机制有了较为详细地表述（示意图如下），这里不再赘述。但需要大家了解到Darsha和Dicer酶在其中扮演着重要角色，这也是isomiRs产生的重要因素之一。

图1 动物和植物体内miRNA的形成原理

IsomiRs的产生机制主要有：miRNA加工和成熟过程中Darsha和Dicer酶的不精确或选择性剪切；3'端核苷酸添加；RNA编辑和单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphism，SNP)。主要表现为：5'端修剪；3' 端修剪；3'端核苷酸附加和碱基替换。其中，5'端修剪和碱基替换可发生在种子区域内部，产生“种子转移”（seed shifting）【1】。

图2 IsomiRs分类示意图

2. IsomiRs的表达模式与功能

已知miRNA几乎都存在异构体现象，通常， 仅有几种 isomiRs是优势表达的，且大多为有相同靶标的3' IsomiRs，但5' IsomiRs也同样可能存在，这就会产生新的靶标（注意，这里用的是大多，是不是种子区域相同，靶标就一定相同呢？其实不然，这个问题后面会介绍）。isomiRs的表达具有组织和细胞和发育阶段特异性，且最优势表达的并不一定是miRBase收录的序列。此外，isomiRs的表达也是保守的。IsomiRs的功能主要表现在：影响靶向调控效率、影响 AGO 定位和自身的稳定性【2】。

划重点——因此，基于IsomiRs的研究是必要的，而且是十分必要的！

二超越种子序列的靶向识别新机制

前面跟大家说到，种子区域相同，靶标不一定相同。这就是下面要跟大家介绍的miRNA靶向新机制。

1. 5'端种子区域在靶向识别中的作用

首先，我们需要了解经典miRNA靶向机制——基于种子区域与mRNA 3' UTR的互补配对。种子区域被定义为miRNA 5'端2-8nt的7个核苷酸序列，但进一步研究发现，第8个碱基的配对在许多情况下是不必要的，因此，也有将种子区域定义为5'端的2-7nt序列。miRNA家族成员共享相同的种子序列，彼此间互称”姐妹“（sisters）。我们知道，种子区域在进化上高度保守，尽管miRNA介导的详细调控机制仍然难以捉摸，但显然RISC和靶mRNA之间的结合是必要的。许多靶基因生信预测软件正是利用“种子匹配”进行靶基因预测，例如TargetScan等，后来的生信分析及验证结果很好的证明了种子区域在靶标识别中的重要作用。

2. 3'端在靶向识别中的作用

按照经典靶向机制，共享种子序列的miRNA家族成员应当具有共同的靶标谱，然而事实是它们的靶标谱是非重叠的。这里要提到CLIP-seq技术（交联免疫沉淀结合高通量测序技术），一些研究中，靶序列与miRNA靶向识别，产生miRNA-靶标嵌合reads（chimeric reads），这些类型的测序reads允许明确鉴定哪种特定miRNA将AGO募集到特定靶位点。最新的研究表明，miRNA与靶mRNA序列识别时，种子区域首先结合，然后3'端的核苷酸也与靶位点结合。基于CLIP技术的研究显示，培养的人类细胞，小鼠大脑和幼虫阶段秀丽隐杆线虫产生的miRNA-靶标嵌合体在不同家族成员间是不同的。这些证据表明3'端序列可以影响靶向的特异性，调节机制和miRNA自身稳定性【3】。

3. 编码区的靶向识别与调控

通常认为，动物体内miRNA靶向mRNA的3' UTR，但张等人的研究表明，CDS区含有新的miRNA–Target识别元素（miRNA recognition elements, MREs）【4】。奇怪的是，该位点缺乏种子序列配对，除了6nt的G：U摆动和12nt处的C凸起外，与miR-20a的5-23nt序列完全互补，这些MREs显然抑制翻译而不引发mRNA去稳定化。

图3 miRNA–Target不同结构和位置产生不同调节结果

重点又来了——总而言之，miRNA中的每个核苷酸都有可能有助于整体结构配对，进而影响靶标的识别和调节以及miRNA的稳定性。

三案例分享

题目：3' Uridylation Confers miRNAs With Non-canonical Target Repertoires

期刊：Molecular Cell

IF：14.548

2019年6月6日，研究者在Molecular Cell上在线发表了题为3' Uridylation Confers miRNAs With Non-canonical Target Repertoires的文章【5】，揭示了一种3'尿苷化调控miRNA靶向识别的全新机制。他们发现isomiR尾部中的尿苷(U)可以和靶mRNA序列上游的腺苷(A)形成配对。这种额外的配对使得3'尿苷化的isomiR可以不依赖于seed配对来识别一类非经典靶位点。这项工作对于理解细胞如何通过尿苷化来调控miRNA靶向识别，以及揭示isomiRs的特异功能迈出了重要的一步（文献解读见：http://www.sohu.com/a/319092799_650136，侵删）。

小编寄语

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参考文献：

【1】 Neilsen C T, Goodall G J, Bracken C P. IsomiRs—the overlooked repertoire in the dynamic microRNAome. Trends Genet, 2012, 28( 11) : 544-549.

【2】 徐畅青, 相升龙, 郭丽. miRNA异构体:miRNA序列多样性. 中国生物化学与分子生物学报, 2016(1).

【3】 Laura B. Chipman and Amy E. Pasquinelli. miRNA Targeting: Growing beyond the Seed. Trends Genet, 2019, 35(3): 215-222.

【4】  Zhang, K, et al. A novel class of microRNA-recognition elements that function only within open reading frames. Nat. Struct. Mol. Biol. 2018, 25, 1019-1027.

【5】 Yang A, De Ros X B, Shao T J, et al. 3' Uridylation Confers miRNAs with Non-canonical Target Repertoires. Molecular Cell, 2019, 75, 1-12.

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