论文标题：The subunit of RNA N6-methyladenosine methyltransferase OsFIP regulates early degeneration of microspores in rice
刊登日期：2019年05月
发表杂志：PLoS Genetics
影响因子：5.57
研究机构：中山大学张月琴/张玉婵课题组
N6-甲基腺苷（m6A）RNA甲基化在不同物种的发育过程中起重要作用。然而，单子叶植物中m6A RNA甲基化的知识仍然有限。中山大学陈月琴/张玉婵课题组在PLOS Genetics上首次揭示了m6A甲基酶复合体中的OsFIP蛋白在植物早期孢子发生中起着不可或缺的作用。该研究还为水稻和拟南芥之间m6 A RNA甲基转移酶复合物的不同功能提供了证据。在阐明植物m6A甲基化机制及其功能方面的大部分进展都是在拟南芥中取得的。在拟南芥中，METTL3的同源体是mRNA腺苷甲基化酶(MTA)。MTA的失活导致m6A甲基化降低，发育中的胚胎不能跨越球状期。AtFIP 37是拟南芥中哺乳动物WTAP的同源体。AtFIP 37基因敲除突变体表现出胚胎致死表型，这是由于胚乳发育和胚胎停滞引起的。
在这项研究中，作者发现OsFIP和OsMTA2是水稻中m6 A RNA甲基转移酶复合物的组分，并揭示了m6 A RNA甲基化在植物孢子发生调控中以前未知的功能。重要的是，OsFIP对水稻雄性配子发生至关重要。敲除OsFIP导致在空泡花粉阶段的小孢子早期退化并同时引起前期I的异常减数分裂。进一步分析了WT和OsFIP功能丧失植物在孢子发生过程中水稻m6 A修饰的概况，并确定了水稻穗特异性m6A修饰的motif“UGWAMH”。有趣的是，研究人员发现OsFIP直接介导一组苏氨酸蛋白酶和NTP酶mRNA的m6 A甲基化，并且对于它们的表达和/或剪接是必需的，这反过来又调节孢子发生的进程。该研究结果首次揭示了OsFIP在植物早期孢子发生中起着不可或缺的作用。该研究还为水稻和拟南芥之间m6 A RNA甲基转移酶复合物的不同功能提供了证据。OsFIP和OsMTA2是水稻m6A甲基转移酶的两个亚基作者将水稻蛋白序列与拟南芥以及哺乳动物中m6A甲基化转移酶进行blast比对，有五个候选蛋白分别是OsMTA2 (LOC_Os02g45110)、OsFIP (LOC_Os06g27970)、OsMTA1 (LOC_Os01g16180)、OsMTA3 (LOC_Os03g05420)以及 OsMTA4 (LOC_Os10g31030)。
作者使用CRISPR-cas9构建了5个突变株分别用mta2、fip、mta1、mta3和mta4来表示。Dot Blot实验表明OsFIP和OsMTA2敲减后m6A整体水平显著降低，过表达2个基因则能够调节水稻生长有显著调节作用。而其他突变体并未观察到m6A水平有明显变化，水稻表型也并未出现明显差异。酵母双杂实验表明OsFIP和OsMTA2这2个蛋白能互作，而其他3个蛋白则不能互作。OsFIP和OsMTA2突变体表型分析揭示OsFIP在孢子形成中的作用作者对突变体水稻fip和mta2以及过表达水稻OXFIP和OSMTA2进行表型观察。
在营养阶段，四种突变植物的表型看起来正常并且与野生型WT相似，只有纯合子植物的分蘖数（每株植物约1.4个分蘖）小于WT（每株约4.7个分蘖）。然而，在发育后期，与WT相比，fip几乎完全不育并且呈现缩短的圆锥花序和花药，并且有效种子数减少，而OXFIP具有更长的花药，更长的圆锥花序比，WT有更高的种子数和结实率。对于mta2和OXMTA2，与WT植物相比，穗长，育性和有效种子数也减少但是高于fip。为了理解导致mta2和fip不育的原因，作者检查了上述四种突变体的雌蕊和雄蕊结构。突变体的所有成熟雌蕊的胚囊发育均正常，表明mta2和fip的低凝固率可能与雌蕊发育无关。然而检查了花粉粒后发现fip花药的花粉粒很少且缺乏淀粉，mta2和OXMTA2只有少量的花粉粒。这表明OsFIP在小孢子发育中起重要作用。
通常认为种子发育也影响植物结实率。因此作者在授粉后21天分析了突变体的种子以研究种子发育过程。在纯合mta2圆锥花序和OXMTA2圆锥花序已经败育的种子中，大部分卵巢被授粉但未完全发育。而纯合的fip植物中的几乎所有卵巢都显示出未授粉的。
总之这些结果表明OsMTA2在调节水稻与拟南芥之间的胚胎发育中具有保守作用，并且OsFIP是孢子生成和胚胎发育的关键基因。作者推测孢子发育失败是fip突变体中结实率降低的主要原因，并且孢子生成先前并未有m6A修饰报道，作者逐渐将目标锁定OsFIP。
OsFIP在空泡化小孢子和绒毡层细胞中增强信号。这表明小孢子的退化可能从空泡阶段开始，OsFIP可能涉及小孢子发育过程。
作者进一步研究了第6阶段到第12阶段的WT和纯合的fip花药之间的超微结后表明，OsFIP在空泡花粉阶段影响小孢子的早期凋亡。作者在早期小孢子阶段和空泡阶段对fip花粉粒进行了TULNEL测定后表明fip花粉粒从早期小孢子阶段开始退化，在空泡化阶段变性变得明显。为了确定小孢子的退化是否是由减数分裂失败引起的，作者随后研究了fip植物的减数分裂过程。通过一系列手段验证作者推测OsFIP对于从空泡阶段到成熟阶段的小孢子发育至关重要。总之，以上数据均表明OsFIP对于水稻中的孢子发生是重要的，并且OsFIP的功能丧失主要诱导在空泡花粉阶段的小孢子变性并且部分地干扰减数分裂事件。
OsFIP对早期孢子发育过程中mRNA上的m6A修饰至关重要
总之，以上数据均表明OsFIP对于水稻中的孢子发生是重要的，并且OsFIP的功能丧失主要诱导在空泡花粉阶段的小孢子变性并且部分地干扰减数分裂事件。OsFIP对早期孢子发育过程中mRNA上的m6A修饰至关重要作者在PMS和EMS对WT和fip的花药进行了m6A测序后发现，fip花药中m6A peaks数量远远小于WT花药。这些结果表明减数分裂期间大多数m6A修饰依赖OsFIP起作用。水稻中motif UGWAMH（W=U/A; M=C/A; H=U/A/C）在WT中占比最高，这与拟南芥中的motif RRACH（R=G/A; H=A/C/U）也与水稻愈伤组织RAGRAG的保守motif不同，但与水稻叶片“UGUAMM”相似。表明在孢子发生过程中对m6A修饰位点的识别可能与其他发育阶段不同。接下来，我们分析了水稻基因中m6A峰的分布。在PMS和EMS的WT穗和fip穗中3'UTR有m6A peak富集。有趣的是，水稻孢子发生过程中的m6A修饰分布模式不同于水稻叶片和愈伤组织，其中大多数m6A峰位于3'UTRs和CDS的起始处。差异可能与m6A修饰在不同发育阶段的变异调节作用有关。作者比较了WT和fip之间的fip穗中mRNA及其m6A修饰水平。大约58％的差异表达的mRNA，在fip穗中也具有较少的m6A修饰，在fip穗中上调。下一步作者设计了GFP标记的OsFIP或OsMTA2蛋白与RNA探针进行binding测试，这些RNA探针编号为1到5，包括——探针1在哺乳动物GAACU中具有已知的m6A motif，探针3和探针5分别具有水稻穗特异性基序UGUAAU，探针2具有突变motif UGAAUU，探针4具有突变motif UGUAU。后期通过用m6A抗体进行免疫印迹和下拉测定来测量RNA探针的甲基化和结合。这块实验与马闯课题组方法较为类似（客户文章 | Plant Physiology玉米m6A进化由基因组重复事件介导）。结果与预期吻合，OsFIP和OsMTA2与水稻花粉特异性motif或哺乳动物motif的结合效率高于突变motif的结合效率。此外，OsMTA2-OsFIP复合物或OsMTA2本身在体外表现出针对水稻花粉特异性motif和哺乳动物motif的m6A甲基转移酶活性，但对突变motif显示较少的甲基转移酶活性。因此，通过识别水稻穗特异性motif UGWAMH ，OsFIP对于孢子发育期间大多数mRNA上的m6A修饰至关重要。OsFIP直接与苏氨酸蛋白酶和NTP酶的mRNA结合并介导其m6A修饰作者通过对m6A测序中表达差异基因及m6A差异进行GO功能富集分析后，将重点关注到了苏氨酸蛋白酶和NTP酶，并进行了m6A-IP-qPCR验证。同时FLAG标签蛋白标记的OXFIP进行OsFIP-RIP实验后也发现，IP产物中也包含了苏氨酸蛋白酶和NTP酶。
已知的NTP酶影响水稻雄性不育，突变体表型实验也证实了这一观点。总之，OsFIP和OsMTA2是水稻中m6A甲基转移酶复合物的主要成分且两者互作，对水稻生殖发育至关重要。通过介导一组苏氨酸蛋白酶和NTP酶基因的m6A修饰，OsFIP是水稻早期孢子形成关键因素之一。另外作者还报道了在WT和fip的孢子形成过程中水稻m6A修饰的特征，并鉴定了水稻孢子形成阶段特异性m6A修饰基序UGWAMH。陈月琴课题组所做工作具有一定的开创性，是第一篇关于m6A writers在植物孢子发生中起重要作用的研究。