m6A去甲基化酶FTO的难产之路 | m6A八卦故事

前言

作为当红炸子鸡的RNA甲基化修饰m6A现在可谓炙手可热风头正盛。我们在研究科学问题的同时，科学故事也非常重要。如果回顾m6A的历史我们会发现，这种特殊的RNA碱基修饰早在上世纪70年代就被发现了。受到技术瓶颈的限制，通量过低以及各种RNA突变所带来的噪音曾经让m6A测序的发明人，以色列特拉维夫大学Gideon Rechavi教授十分无奈。加上人们一直认为RNA碱基修饰是不可逆的，使得m6A在被发现的四十年里一直在坐冷板凳。但是何川教授首次鉴定FTO为m6A去甲基化酶的2011年以及m6A测序技术公布的2012年使得m6A一下子成为表观遗传学的新宠儿。笔者打算FTO这段惊心动魄的历史记录下来。

本文文字以及部分图片参考了2017年BioArt创始人丁广进博士的文章“致敬何川教授：RNA表观遗传领域的杰出领导者”以及NatureNews发布的“An epigenetics gold rush: new controls for gene expression”。再次向整理内容的创作人表示感谢。Jaffrey与贾桂芳何川关于FTO底物究竟是m6A还是m6Am的这部分内容整理自段洪超博士（师从贾桂芳老师）。

正文

也许从FTO被发现的那一刻起，人们仅仅会认为这个蛋白可能会与人的肥胖有关。要知道在十多年前，GWAS分析和meta分析可是当时最时髦的东西，风头不亚于现在的高通量单细胞技术。就这样在2007年，来自英国法国意大利的科学家分别在Nature Genetics（PMID: 17496892）、Science（PMID: 17434869）、PLoS Genetics（PMID: 17658951）各自发表了独立研究，证实FTO是一个与肥胖相关的基因。

许多研究在开始也就是个相关性罢了，但是这个神奇的蛋白从被鉴定到大放异彩也仅仅走过了12个年头而已，这中间的起起伏伏串起了科学界最为惊心动魄的故事之一，在生命科学史留下了灿烂的一笔。

付晔博士是这个故事的主角之一，作为首个鉴定FTO蛋白在体内能够对m6A修饰的腺嘌呤进行去甲基化修饰的见证人之一（另一位是贾桂芳博士），那段苦涩的岁月他似乎给他带来了…………额……似乎并不是那么美好的回忆。“我几乎都快觉得我永远都不可能找到FTO的功能了。”付晔苦笑着说到。

在芝加哥大学何川实验室拿到博士学位后，付晔目前正在哈佛大学的庄小威实验室进行博士后训练。这位传奇的华人女科学家是上世纪80年代中科大杰出校友的代表之一，何川教授也毕业于中科大。可以说当时的中科大风头远胜于北大清华，这些中科大的校友们成为了今后30年中美学术界的中坚力量。

襁褓之中的FTO

就在英法意科学家在2007年通过GWAS等方法鉴定到FTO基因不久，同年的一篇以Report短文形式发表在Science（PMID: 17991826）的论文也证实FTO蛋白能够在体外催化2-氧戊二酸依赖的单链DNA甲基化。这支来自英国牛津大学的团队还在文末暗示FTO可能会对RNA有去甲基化的作用。

作为化学系出身的何川教授其实一开始关注的重点并不是RNA表观修饰，这位来自贵州的天才少年1989年考入中科大应用化学系，在2000年从MIT获得博士学位，师从生物无机的大牛院士StephenJ. Lippard教授。在哈佛大学跟随Gregory L.Verdine教授完成两年短暂的博后训练后才转入核酸方向研究，并在芝加哥大学建立了自己的实验室。在不到八年的时间内连续晋升为副教授和正教授，何川教授打破了芝加哥大学理学院之前副教授到正教授两年半的记录。

2008年的何川教授尽管风头正劲，但他仍然为如何开展新的研究方向绞尽脑汁。此时美国的NIH正好打算推出一系列项目资助一些高风险高收益的研究课题，何川教授也想展开尝试。

之前何川教授主要研究方向主要集中在DNA修复上，这些工作的重心仍然是偏化学方向。其中一篇代表作发表在了2008年的Nature主刊（PMID: 18432238）上，研究内容主要是首次解析了AlkB-dsDNA和ABH2-dsDNA复合体的晶体结构，从而解释了参与DNA损伤修复的烷基化酶AlkB识别损伤后的DNA的分子机理，第一作者分别为杨财广（中科院上海药物所PI，杰青获得者）和伊成器（北大生科院PI，青年千人获得者）。其中杨财广教授后续又跟m6A结下了不解之缘，FTO抑制剂的故事后面会详细介绍。

一项伟大的工作往往会从一个不起眼的角落里发起进攻，在另一个意想不到的地方生根发芽。我们所熟知的FTO蛋白实际上属于AlkB蛋白家族中的一员，也被称为ALKBH9。FTO属于α-KG依赖的双加氧酶ALK家族的蛋白，但是关于FTO的作用底物，仍是未知的。

如何从DNA修复到RNA表观修饰完成惊鸿一跃，这个来自AlkB蛋白家族的FTO蛋白将会在接下来的三五年内成为何川教授课题组转型的秘密武器。

也许是幸运女神的眷顾，有一天何川教授偶然碰见了在同一栋大楼里工作的潘滔教授，潘滔教授是芝加哥大学的一位分子生物学家，专门研究RNA上一种特定的化学修饰——甲基化修饰。自此之后，两人频繁会面，经过一次次激烈的讨论，一个大胆的想法逐渐成型。

潘滔教授与何川教授合作初期仍然将目光锁定在了DNA修饰以及对应的组蛋白上。在当时无论是研究手段还是已发表的高质量论文，与DNA修饰相比，RNA修饰的相关论文数量都不在一个等级，RNA修饰研究仍然只停留在鉴定的原始阶段。FTO的结构分析显示它的底物很可能是单链的RNA，那么具体是RNA上的哪种修饰呢？更进一步说，假设这些RNA修饰是可逆的话，那么这些修饰很有可能是参与基因转录翻译的一个重要的标记。

何川教授也许很少当面提及当年的路走的有多艰难。不管怎么说，我们仍然相信AlkB蛋白家族给了何川教授源源不断的灵感，选中FTO并不是空穴来风而是在原有的基础上进行创新。一场好戏即将开始。

小荷才露尖尖角——FTO闪亮登场

马上在2008年，何川教授首先在FEBS Letter（PMID: 18775698）发表文章证实FTO蛋白能够在体外氧化RNA单链上的甲基化修饰（也被称为去甲基化修饰）。这篇文章的第一作者正是大名鼎鼎的贾桂芳博士，目前已经回到北京大学担任PI。她并没有将原来的脚步停下，而是将m6A修饰的战火燃向了植物领域。

尽管FEBS Letter的影响因子已不足3分，但是细胞自噬的发现者日本科学家大隅良典的那篇文章也发表在这个杂志上。从此何川课题组的贾桂芳和付晔在接下来的三年里将与FTO长伴相随，痛苦与折磨也随之而来。

2009年，潘滔教授与何川教授获得了充足的经费支持，正式开始寻找RNA上的可逆化学标记，以及与之对应的擦除标记的蛋白质。何川教授坚信FTO会起到很大的作用，只不过要找到真正的底物真的不容易。要从一百多种RNA修饰中找到真正的答案对贾桂芳和付晔来说才是真正的挑战。

贾桂芳和付晔等人开始合成带有不同修饰的RNA片段，然后一个一个尝试，看FTO是否对这些RNA上的碱基有去修饰作用。在整整三年的时间里，他们失败了无数次，于是才有了付晔博士那句经典的台词——“我几乎都快觉得我永远都不可能找到FTO的功能了”。

人在连接失败的打击下是很容易怀疑自己当初的选择是否正确，许多重要科学成果的发现并不像文人描绘得那么浪漫。睡一觉梦见猴子手牵手发现苯环结构，磕个药发明了PCR反应只存在语文课本里。学术界中的真实情况往往会残酷许多。除了和同行竞争外，科学家还要与自己的心理做斗争。许多科学家由于没有坚持或在一个错误的方向上坚持，把一辈子最好的年华都葬送在科学探索的坟场里。

小学生仰慕科学家，灵光一现后就是一个大发现。普通科学家羡慕顶级科学家为何idea总是那么超前。可真实的情况是，这种跟民工并无任何差别的重复劳动才是科学发现的本质。枯燥乏味日复一日的机械劳动会消磨人的意志。好消息是贾桂芳和付晔黑暗时刻即将迎来终结。

2010年，付晔他们终于找到了属于自己的“真命天子”——m6A。这一次，腺嘌呤上的m6A修饰神奇般的消失了。这是RNA上的修饰第一次被证明是可逆的，就像那些在DNA和组蛋白上被发现的修饰一样。对何川教授来说，这个实验结果看上去足以成为证明RNA系统参与基因表达调控的重要证据。同一年，何川教授应邀在Nature ChemicalBiology上发文，首次提出RNA表观遗传学的概念。DNA去甲基化酶TET家族已被报道，人们焦急等待着RNA去甲基化修饰酶究竟是谁，一场风暴即将来临。

这里有一个小插曲，那就是清华大学柴继杰教授（师从施一公教授）于2010年解析了FTO蛋白的晶体结构并将成果以Letter形式发表在Nature主刊（PMID: 20376003）上。这项跨时代的研究无论是为后续开展FTO去甲基化修饰研究还是FTO抑制剂的药物研究都有很大的意义。                            

结构与生化实验显示FTO对3-甲基化修饰的U比T活性更强，表明在体内的生理条件下，甲基化的单链RNA可能是FTO的生理底物。实验结果也对FTO体内的功能方式有提示意义。因为体内甲基化的T很少。而3-甲基化修饰的U存在于核糖体等RNA中，结合其主要结合单链核酸的特性，表明FTO在体内可能通过影响修饰的核糖体的稳定性等来影响脂肪代谢，从而引起肥胖。同时，复合物的结构也为设计通过干扰FTO的酶活性的小分子抑制剂提供了基础。今后关于肥胖及白血病的药物开发最核心最基础的工作都来源于这篇文章。

有趣的是，这篇Nature也引用了何川教授2008年发表在FEBS Letters的那篇文章
2011年谜底在Nature Chemical Biology（PMID: 22002720）上揭晓，何川教授首次证实FTO可以在体内逆转m6A修饰。包括何川教授在内的许多研究者认为这篇文章正式开启RNA表观修饰研究井喷的元年。但是别忘记，2008年才是梦想真正开始的地方。贾桂芳和付晔如释重负。        这场的胜利只能说让付晔等小伙伴暂时得到极其短暂的呼吸权。因为盯上m6A的可不是只有何川课题组。紧接着来自以色列特拉维夫大学的Gideon Rechavi课题组和康奈尔大学医学院的Samie Jaffrey课题组分别在Nature（PMID: 22575960）和Cel（PMID: 22608085）以不到2个月内各自发布了第一篇m6A-seq测序论文。这篇Nature第一作者Dan Dominissini博士师从Rechavi教授，他感叹到“在这之前的许多年里，我们都只能在黑暗中摸索——好在马上就能在宽广明亮的新视野里继续研究了。”于是，Dominissini博士只身从以色列动身前往芝加哥大学，在何川教授实验室开启了自己博士后之旅。完成训练后，Dominissini博士于2017年再次回到以色列建立自己的独立实验室。得益于高通量测序技术的发展，从此人们研究m6A从低通量迈入了高通量时代！时间留给何川教授并不多了，短暂的停顿后何川教授带领课题组的小伙伴们继续前行。在接下来的7年时间里，何川课题组在m6A领域展现出了惊人的爆发力和控制力，逐渐成为表观生物学领域的领军人物。
大杀四方——FTO引爆m6A研究热潮

接下来的故事大家都耳熟能详，尤其是在FTO被发现不久，ALKBH5被鉴定为第二个能够对m6A有去甲基化修饰的催化酶。AlkB家族在m6A去甲基化修饰领域再次增添新的成员。

总的来说围绕催化m6A的酶为METTL3/METTL14/WTAP、去甲基化酶为ALKBH5和FTO以及结合蛋白（Reader）YTHDF家族成员的相关研究陆续出来，那么这个时候整个m6A的研究理论体系就初步建立起来了，再后来就是围着上述蛋白开展相关功能研究了。此外，除了从2008年前后就和何川展开合作的潘滔在上述提及的领域做出过许多重要的贡献之外，来自中科院北京基因组所的杨运桂研究员也做出了许多重要贡献。

杨运桂课题组和何川课题组在Molecular Cell（PMID: 23177736）上的这项研究为原本火热的m6A去甲基化研究再添了一把火。截止2019年，共有上述的这些酶被发现具有催化作用。包括Writers、Erasers、Readers三大类一共20多种蛋白与m6A有关。

从m6A相关论文发表数量来看，2017年后m6A研究的文章数量突破100篇，开始引起各领域研究者的关注。2018年的国自然中标情况，更多反应的是基金标书撰写者在2017年之前的准备工作。所以这里超过100篇文章数量绝对是一个很好的时间节点。截止2019年8月本稿完成之际，Pubmed上已收录m6A论文达167篇。

再来看看2018年的国自然热点，我们发现虽然m6A资助的项目数量不多，但是与2016年与2017年比起来可谓增量不小。这67项资助项目平均资助额度超过45万，总计资助额度接近3000万。而到了2019年国自然资助m6A相关项目资助数量达到156项目，资助总额度更是超过了7000万（2019年国自然m6A项目解析及下载）。

也许何川教授也没有想到，当初FTO这个小小的蛋白居然会带来那么大的能量。

树大招风——FTO的底物究竟是m6A还是m6Am？本来FTO的功能已经被发现了，其他实验室跟在大牛后面一起灌灌水，享受岁月静好大家都会相安无事。无奈就在全世界的科学家往m6A的大厦添砖加瓦之时，表观修饰领军人物也是m6A测序的发明人之一，来自康奈尔大学的Jaffrey教授在2017年的Nature主刊（PMID: 28002401）投下了一颗重磅炸弹。Jaffrey在文章中委婉地表示FTO事实上更多的是催化m6Am而不是m6A去甲基化。为此，贾桂芳老师的博士研究生段洪超表示有不同的观点。其实就在2011年那篇Nature Chemical Biology发表后的两年，贾桂芳和付晔在Nature Communications（PMID: 23653210）对FTO的机制进行了更为详细的研究。在这篇文章中，付晔等人进一步探究了FTO对m6A作用的详细机理，FTO将m6A依次氧化为hm6A、f6A，这两个中间产物不稳定，分别脱除一分子甲醛和甲酸转变为正常的A，FTO对m6A的去甲基作用算是坐实了。段洪超还认为Jaffrey的文章中另一大疑点就是FTO敲除后m6A水平未发生显著变化，仔细研究后发现Jaffrey他们只计算了RRACH中GGA部分的修饰而忽略了RRACH中H中的A碱基修饰。而贾桂芳和付晔则是对所有mRNA上的A碱基修饰状况进行了质谱检测。
为了表示科学公正的态度，贾桂芳老师在Jaffrey的文章发表不久，就分别在HeLa细胞和HEK293T细胞中对FTO进行了敲除实验，并用质谱对m6A和m6Am进行检测，结果发现m6Am的绝对含量大大低于m6A。同时，段洪涛表示付晔的博士论文中还有一些未发表的内容——基于m6A和m6Am的结构相似性预测了FTO同样可以作用于m6Am，并通过实验进行了验证。同时，付晔博士也指出，尽管人们还不知道m6Am的甲基转移酶，但是早年的研究显示，将Am转变为m6Am的酶活性主要是在细胞质当中，而FTO却主要定位在细胞核里，从这个角度考虑，FTO在体内对m6Am的影响究竟有多大，或许还要留一个悬念了。

这场战争没有结束，后来又有了新的动作。陈建军教授和何川教授在2016年的Cancer Cell上发表长文称FTO为急性髓细胞白血病AML的促癌基因后（m6A去甲基化酶FTO对急性骨髓白血病有致癌作用）并没有停下脚步。而是继续在Cell（PMID: 29249359）发表长文，系统分析了白血病中m6Am的丰度，FTO催化m6A和m6Am的偏好性，以及FTO如何通过改变m6A而非m6Am在白血病中发挥功能。

2018年9月，陈建军教授和何川教授再次在MolecularCell（PMID: 30197295）发文，对FTO如何介导去甲基化修饰进行了迄今为止最为全面的研究，似乎有想要结束这场旷日持久的争吵之意。贾桂芳博士也参与了这项重要的研究。这篇文章的主要发现如下：① FTO介导带polyA尾RNA的m6A和m6Am的去甲基化，偏好性受细胞核与细胞质定位影响。不同细胞中FTO的定位不同，细胞核的FTO介导m6A的去甲基化，细胞质中的FTO介导m6Am和m6A的去甲基化② 存在m6Am修饰的RNA拥有更高的稳定性，但是敲低FTO对这些RNA却并没有影响③ FTO可以结合tRNA，发挥tRNA的m1A去甲基化酶作用，并进一步影响蛋白的翻译速度这场争议或许还会持续下去，也许在越辩越明的道路上真理会不断呈现出她原本的模样。过对于一个正在经历蓬勃发展的新兴学科来说，这类分歧实在是再正常不过了。我们现在仅仅只是处在故事的开端。”Rechavi客观地评论道。随着科技的进步，科学家们最终一定能够更加清晰地理解这些分子标记。这类研究工作中蕴含的无限可能性让康奈尔大学医学院的Christopher Mason每天都觉得自己非常幸福，“能够在这个领域工作真是太好了。”是终点也是新的起点——FTO转化医学之路还记得何川老师早年的那位博士生杨财广吗？杨财广博士在回到中科院上海药物所后发表了一系列高水平的内容。终于在2019年的4月，他的生命里与曾经的导师何川教授产生了交集与碰撞。这篇发表在Cancer Cell（PMID: 30991027）上的文章，杨财广课题组与陈建军课题组和钱志坚课题组合作，设计了FTO小分子抑制剂。这种小分子化合物能够选择性地抑制AML细胞中FTO的去甲基化功能，上调AML关键基因mRNA上m6A修饰，增加抑癌蛋白质例如ASB2和RARA的丰度，降低促癌蛋白质例如MYC和CEBPA的丰度，从而抑制AML细胞增殖，并且在PDX小鼠模型上展现抗白血病的治疗效果。此项研究从分子以及细胞层面上较充分表征了FTO抑制剂的选择性和靶向性，但其细胞内的作用机制尚需深入探索。由于FTO以及m6A修饰在实体瘤中也发挥关键的调控作用，该项研究针对RNA去甲基化酶FTO能否作为抗肿瘤药物靶标实现了药理功能确证，指明了分子靶向性干预m6A修饰从而影响基因表达来实现抗肿瘤的研究新方向。

同样，来自中山大学药学院的王红胜教授，在预印本BioRivx（https://www.biorxiv.org/content/10.1101/614859v1）发表了名为Targeted mRNAdemethylation using an engineered dCas13b-ALKBH5 fusion protein的文章。在该研究中，王红胜课题组基于CRISPR-cas13技术，将dpspcas13b中Dead VI-b型cas13酶与ALKBH5融合（命名为dm6ACRISPR）来靶向m6A甲基化mRNA。来自王红胜课题组的黎婕昕博士为这项工作的主要完成人。

总之由FTO开启的m6A黄金时代才刚刚开始，再次致敬所有在RNA表观遗传学上坚持的科学家们！

小编说：

历史上一些具有重大进程的关键性事件，往往在当时发生的那一刻显得平淡无奇。而吵吵闹闹的科学性热点事件最后都消失了无影无踪。要想永攀科学高峰，作为PI本人需要有海量的idea池才能保证自己至少在3-5内不会被淘汰。经费是否充裕也是许多实验成功的关键所在。最后请不要小看那种枯燥的重复劳动，往往成功不仅要拼脑力还要拼体力拼运气，试想你连体力都不肯付出，幸运女神如何降临到自己身上呢？

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