吸烟诱导m6A上升促进miR-25-3P加工影响胰腺癌进展 | m6A专题

论文标题：Excessive miR-25-3p maturation via N6-methyladenosine stimulated by cigarette smoke promotes

Pancreatic cancer progression

刊登日期：2019年04月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：11.878

研究机构：中山大学肿瘤防治中心林东昕/郑健课题组，徐瑞华课题组

摘要

m6A修饰可调控miRNA的加工和成熟，但其异常调控在人类疾病中的作用仍不清楚。在这篇文章中，作者发现烟草冷凝物（cigarette smoke condensate, CSC）通过m6A-NKAP通路促进了胰腺导管上皮细胞中有促癌功能的miR-25的成熟。miR-25成熟后抑制了PHLPP2活性，导致致癌性AKT-p70S6K信号转导的激活，最终引起了胰腺癌。此外，该研究还揭示了烟草冷凝物促进m6A修饰的机制：通过降低METTL3基因启动子区域的甲基化，从而增强METTL3的表达和m6A水平。总体来说，该文章将m6A，miRNA和癌症这三个研究热点结合在一起，又探究了m6A甲基化酶上游调控机制，前后做的相对完整。

流程图

CSC增加胰腺导管腺癌细胞中miR-25-3p的含量

基因芯片数据分析显示，CSC处理后的胰腺导管上皮细胞中miR-25-3p被显著调高（调高65倍，所有miRNA中最高）；qPCR结果也显示，miR-25-3p可被CSC处理诱导高表达。

随后，作者又在体内验证这一趋势。结果显示，与正常组织样本相比，胰腺导管腺组织中miR-25-3p表达显著升高。生存分析结果表明，具有高miR-25-3p含量的病人低存活率显著降低。这些临床结果表明了miR-25-3p与胰腺导管腺癌的发生具有显著相关性。

CSC通过作用METTL3促进pri-miR-25的成熟

m6A可调控miRNA的成熟（本公众号曾在m6A专题发布过m6A调控miRNA成熟的文章，感兴趣的小伙伴可向上查看），作者假设m6A甲基转移酶METTL3介导了CSC对pri-miR-25成熟的调控。WB显示CSC确实调高了METTL3的表达。在胰腺导管腺细胞中超表达METTL3，pri-miR-25的表达显著降低，miR-25-3p的表达显著升高；反之，敲低METTL3，pri-miR-25的表达显著升高，miR-25-3p的表达显著降低。进一步，作者观察到METTL3敲低消除了CSC对miR-25-3p表达的影响。这些结果证实，METTL3参与了CSC对pri-miR-25成熟的调控。

那么，CSC是如何促进METTL3表达的呢？亚硫酸氢钠测序表明CSC处理后METTL3基因的CpG岛甲基化水平显著降低。再利用染色质免疫共沉淀实验，作者证实METTL3基因启动子上与之结合的DNA甲基化因子DNMT1、DNMT3a含量显著降低。这些结果表明了CSC通过降低METTL3启动子甲基化，促进了METTL3的表达。

METTL3通过m6A促进pri-miR-25的成熟

在阐述完CSC调控METTL3的机制后，作者进一步验证METTL3通过m6A促进pri-miR-25成熟。首先，利用m6A 单核苷酸分辨率交联与免疫沉淀技术即miCLIP（本公众号做过科普哦），发现在pri-miR-25剪切位点上存在m6A修饰位点（GGACU）。RIP-qPCR分析进一步显示，胰腺导管腺组织中pri-miR-25上的m6A修饰水平显著高于正常组织；CSC处理后的胰腺导管腺细胞中pri-miR-25上的m6A修饰水平显著高于对照组。

为了直接证明METTL3通过m6A促进pri-miR-25成熟，作者首先在胰腺导管腺细胞中干扰和超表达了METTL3，结果显示超表达METTL3使得pri-miR-25上的m6A修饰升高，反之降低。然后构建pri-miR-25的m6A突变位点质粒，发现在m6A位点突变后，pre-miR-25和miR-25-3p含量显著降低，说明此突变抑制了pri-miR-25的成熟。这些结果共同证明了CSC通过METTL3-m6A调控pri-miR-25的成熟。

NKAP是m6A对pri-miR-25的“阅读器”

熟悉m6A的老司机都知道，m6A发挥作用需要阅读蛋白的介导。在本研究中，作者首先利用蛋白质谱法，从m6A- pri-miR-25结合的蛋白和DGCR8（促进miRNA成熟因子）结合的蛋白交集中，筛选出9个核蛋白，再利用蛋白免疫共沉淀的方法，鉴定出只有NKAP同时与m6A- pri-miR-25和DGCR8结合，表明了NKAP可能是pri-miR-25上的m6A阅读蛋白。

进一步利用NKAP iCLIP-seq，发现NKAP蛋白与pri-miR-25的m6A区域完全重合，这表明NKAP蛋白紧紧集合在pri-miR-25的m6A位点上。

敲低NKAP后显著降低了miR-25-3p的含量，同时也消除了CSC对miR-25-3p表达的促进作用。另外，NKAP的敲低也显著减弱了DGCR8与pri-miR-25的结合，这表明NKAP招募了DGCR8，进而介导了miR-25-3p的成熟。

最后，针对miR-25-3p如何行使促癌作用，作者发现miR-25-3p抑制了抑癌基因PHLPP2的表达，使得其下游AKT通路被激活，促进了癌细胞的迁移和侵袭。

小结

总体来说，这个工作思路清晰，证据翔实，充分抓住了m6A，miRNA和癌症这三个热点，挖掘出了具有显著表达差异的miRNA，并且用m6A途径解释了miRNA表达的调控机制。利用了诸多目前前卫的实验技术，给文章增添了不少色彩。

进一步地说，如果在实验中得到METTL3或者NKAP敲除小鼠，进行肿瘤移植验证，那么本文的证据会更加充分，档次也会更高。另外，还需要指出的是，从TCGA中挖掘数据发现，miR-25-3p含量与胰腺导管腺癌生存率没有显著联系，作者解释为可能是人种的不同导致，这可能也是文章的一个未发的更好的原因。

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