Nat Com用户m6A文章：YTHDF1影响NSCLC进展 | m6A专题

论文标题：YTHDF1 links hypoxia adaptation and non-small cell lung cancer progression

刊登日期：2019年10月

发表杂志：Nature Communications

影响因子：11.87

研究机构：中科院昆明动物所陈勇彬课题组，第一作者石玉林博士

测序手段：联川生物提供m6A测序、翻译组测序、YTHDF1-RIP-seq

摘要：

在高海拔地区经常出现缺氧现象，这种现象在实体瘤中也存在。陈勇彬课题组前期通过GWAS定位到了YTHDF1。这种在进化选择上的高度适应基因，在非小细胞肺癌（NSCLC）中也有高表达情况。YTHDF1敲除后通过调节CDK2、CDK4和cyclin D1的翻译效率来抑制NSCLC细胞增殖和肿瘤的形成。YTHDF1的高表达与更好的临床结果相关，敲除后使癌细胞对顺铂具有耐药性。文章整体确定了YTHDF1下游调控的Keap1-Nrf2-AKR1C1通路。

癌症相关的基因快速进化分析

由于缺氧会影响许多肿瘤相关基因的表达从而成为促进肿瘤恶化的驱动基因。作者前期通过SNP芯片及挖掘公共数据库等方法，证实藏族人群肿瘤相关基因进化速度更快，这个结果在六种藏区特有动物身上得到验证。

由于表型的进化与基因表达的变化紧密相关，因此作者推测肿瘤相关基因除了改变DNA序列外，还可能会改变高原地区哺乳动物mRNA的表达情况。这个猜测最后通过转录组测序得到验证，此外差异基因大多数集中在细胞凋亡侵袭等通路上。

有趣的是，作者还发现西藏地区癌症患者（包括肺癌，大肠癌，肝癌和乳腺癌）的死亡率显着低于其他所有省份（补充图1c，d）。以上证据可以推测低氧适应选择的基因中可能存在癌症相关标记基因。

之后作者从藏猪、狗、羊等几种哺乳动物中，通过GWAS等方式选定YTHDF1和TEX2这两个基因，作为可能影响肿瘤进展的候选基因。

YTHDF1在低氧适应和癌症进展中的作用

由于TEX2相关文献记载较少，作者将目标锁定在一种名为YTHDF1的m6A阅读蛋白身上。前面GWAS研究中定位到的YTHDF1并没有出现氨基酸变化，作者证实YTHDF1的mRNA表达发生变化且出现显著下降。

下一步作者在正常人支气管上皮细胞中对YTHDF1进行敲低后发现，YTHDF1敲低影响了低氧诱导细胞凋亡的相关蛋白并通过WB得到了验证。

此外作者还发现了YTHDF1靶向的含有m6A修饰的mRNA具有潜在作用。作者在数据库中发现各种肿瘤中经常发生突变和扩增，如肺癌、结直肠癌、胰腺癌等。如同KRAS一样，YTHDF1在各种肿瘤中也经常发生突变和扩增。

由于已经充分确定了由非小细胞肺癌NSCLC中由于缺氧引起的分子事件变化能够驱动耐药性，增强上皮向间充质转化，重塑细胞外基质，支持癌症干细胞并促进逃避非小细胞肺癌和其他低氧肿瘤的免疫监测，。作者决定重点关注YTHDF1在NSCLC中的功能角色。

与网上已公布的数据库来看，与癌症癌旁组织测序结果相比，NSCLC癌组织和7种常见的细胞系中YTHDF1的蛋白和mRNA表达都更为突出。

YTHDF1调节NSCLC细胞增殖

作者发现敲除YTHDF1能够抑制肺癌细胞增殖，过表达YTHDF1表型能够得到补救。TMT蛋白组结果分析表明，与细胞周期调节相关基因如CDK2、CDK4及cyclin D1可能起到主要作用。作者通过流式细胞仪对肺癌细胞系进行细胞周期调节进行了实验验证，发现YTHDF1敲除后G0/G1期细胞显著增加，p27蛋白表达显著升高，G0/G1细胞周期过渡关键调节因子如CDK2、CDK4和cyclin D1蛋白表达均显著下降，而mRNA水平未发生显著变化。后面作者通过m6A测序、翻译组测序、RIP-seq联合分析表明，CDK2和CDK4在可视化软件IGV中均观察到了m6A的Peak峰和YTHDF1的RIP-seq的Peak峰出现了重叠（IGV和Adobe AI制作RIP-seq Peak图简易教程 | m6A专题 ），YTHDF1敲除后翻译效率显著降低。

YTHDF1敲除在体内抑制肺癌进展

PDX模型鼠实验证实，注射YTHDF1干扰shRNA细胞系与空白对照shRNA肺癌细胞系相比，YTHDF1敲低后PDX小鼠体内肿瘤的重量和体积显著下降。

接下来作者将YTHDF1lox/lox小鼠（Y）与KRASG23D及Trp53lox/lox（KP或K）肺ADC小鼠进行杂交，产生后代为KPY和KY。后期通过免疫组化等一系列实验证实，与KP（或K）小鼠相比，KPY（或KY）小鼠的肺肿瘤中Ki67染色所证实的增殖率较低，CC3阳性细胞增加，这表明YTHDF1缺失对肿瘤具有抑制作用。

YTHDF1与NSCLC临床结果呈正相关

作者发现在NSCLC组织和癌细胞系中YTHDF1表达显着增加。接下来作者调查了YTHDF1在NSCLC中的蛋白表达和细胞定位，并对肺癌和非癌组织NCLT进行了免疫组化染色。在NSCLC组织中，YTHDF1阳性表达的百分比（55.9％；272/487）显着高于在NCLT组织中（42.1％；64/152）。

出人意料的是，当分析YTHDF1蛋白水平与总生存率之间的相关性时，作者注意到YTHDF1高表达患者的临床结果更好。这个结果与1926名肺癌患者的表达谱芯片数据集吻合，获得了相似的结果。

为了找到YTHDF1低表达导致生存更差的潜在机制，作者重新分析了免疫组化数据后发现462例NSCLC患者接受了铂类化疗（441/462）或放疗（21/462）治疗，25例患者同时接受了化疗和放疗。由于顺铂是这些患者一线治疗选择的药物之一，因此作者认为高表达或低表达的YTHDF1可能在术后对顺铂产生反应的癌细胞分别有致敏或抑制效应，继而反过来导致整体生存率提高或降低。

为了在体内验证该假设，作者将KP和KPY小鼠经鼻吸入PBS腺病毒载体或注射顺铂。结果表明顺铂处理后，KP小鼠相比KPY小鼠，肿瘤负荷得到了显着抑制。此外肿瘤数量，肿瘤大小和Ki67阳性细胞数目的显着减少以及伴随CC3阳性免疫染色的增加从侧面也证明了前面的结论。

小鼠PDX模型以及对顺铂耐药的A549细胞系等实验也从多个方面证实了相似结论。

YTHDF1通过调控Keap1-Nrf2-AKR1C1发挥作用

缺氧可通过能量剥夺和自由基形成（包括过量的ROS生成）诱导细胞凋亡。低氧实体瘤中发生的低氧水平通常与对放疗、化疗或靶向疗法的耐药相关。ROS是由线粒体和其他细胞成分以及包括缺氧、吸烟、污染物、化学药物和放射在内的外部因素代谢产生的副产物。Nrf2是在内源性抗氧化剂过程中起关键作用的转录因子，它调节抗氧化基因的表达，包括AKR1C1、AKR1C2、HO-1和NADPH。Keap1对Nrf2有负调作用，Nrf2在氧化应激条件下失活。

作者重新分析了TMT质谱数据后发现，Keap1和Nrf2在YTHDF1敲低时受到反调控，如Keap1减少但Nrf2及其下游响应因子AKR1C1蛋白表达增加所显示。所以作者决定验证Keap1-Nrf2-AKR1C1调控网络是否是响应缺氧或顺铂诱导的细胞凋亡的YTHDF1功能介体。

首先qPCR实验表明在顺铂处理后，Keap1和Nrf2的mRNA不受影响。但是WB显示顺铂处理后，YTHDF1敲除会导致Keap1减少，而Nrf2和AKR1C1增加，同时伴随着Nrf2蛋白的在细胞核内积累，Nrf2蛋白是激活Nrf2及其下游靶向基因（包括AKRs）的标志物之一。

为了进一步确定AKR1C1是否介导YTHDF1对顺铂处理后的细胞应答调节，作者设计了BPS（一种基于AKR1C149结构的小分子抑制剂）来抑制AKR1C1，并发现BPS联合顺铂使用会发挥更好的作用。CC3和PARP和WB结果也证实了这一点。

此外，作者发现顺铂耐药细胞系A549/DDP中的一些关键基因的m6A修饰水平出现差异而mRNA并无表达差异，如YTHDF1结合的Keap1转录本的m6A修饰水平出现显著降低，继而导致降低其翻译效率，导致蛋白水平下降。

作者接下来对KP和KPY小鼠进行免疫组化后发现，KP小鼠肿瘤组织中Keap1阳性程度更高。另外免疫组化结果也表明YTHDF1呈阳性的组织中70.6%的AKR1C1呈现阴性，40.5％YTHDF1阴性的NSCLC组织AKR1C1呈阳性。这些结果说明YTHDF1与AKR1C1呈负相关。此外，YTHDF1阴性和AKR1C1阳性NSCLC患者的总生存率显着低于其他免疫型患者。

最后由于AKRs蛋白家族成员对于ROS清除也很重要，因此作者假设在抵抗低氧诱导的细胞凋亡的YTHDF1敲除BEAS-2B细胞中也采用了相同的机制。不出所料，作者发现细胞凋亡减少。

总结

总之陈勇彬的研究结果表明YTHDF1作为m6A修饰后的RNA结合蛋白家族成员之一，在高原家养哺乳动物中低表达，而在正常肺上皮细胞中抑制其表达可以抵抗低氧诱导的细胞凋亡。深入研究发现，YTHDF1在非小细胞肺癌肿瘤组织和细胞系中均高表达，其在正常氧气浓度的条件下通过加速CDK2和CDK4等细胞周期蛋白的表达来促进肿瘤细胞的增殖；而在铂类药物为主的化疗压力环境下，由于YTHDF1高表达促进了Keap1蛋白的表达，导致Nrf2转录因子的迅速降解和下游耐药基因AKR1C1的沉默，因此肿瘤患者对化疗更敏感且总生存时间更长。

该研究表明，利用极端环境生存的非模式动物基因组，通过进化生物学方法筛选低氧适应的相关基因，可以为低氧实体瘤新生物标志物的挖掘提供新的研究方法，提示交叉学科在未来医学生物学研究领域具有重要的应用前景。

相关阅读