16S rRNA基因测序无疑是研究微生物群落多样性的首选工具，不仅能鉴定菌群的整体构成，筛选出显著差异菌群，甚至还能预测菌群的基因功能。这样看起来，做宏基因组测序除了锦上添花，像也没有更多作用了？显然不是，在高分文章中，绝大多数情况下都是采用宏基因组测序的结果来做讨论。我们先看下面这项研究，最后再说明为什么要做宏基因组测序的原因。这项研究发现一个有趣的现象，在前驱糖尿病小鼠模型中，高脂饮食和高糖饮食会塑造小鼠不同的肠道菌群组成，然而它们菌群的基因谱和代谢谱却是相似的。
发表期刊：mSystems
影响因子：6.519
发表时间：2019
研究内容：由高能量饮食（HED）诱导的前驱糖尿病小鼠的肠道菌群与代谢组变化
样本设计：高脂（HF）饮食 vs 高糖（HS）饮食 vs 对照（NC）饮食；
样本类型：小鼠粪便
实验方法：16S rRNA基因测序+宏基因组测序+非靶向代谢组
多种饮食均可导致2型糖尿病，而2型糖尿病患者的肠道菌群也各有不同。那么问题来了：1）不同的促肥胖饮食诱导的肠道菌群之间是否存在共性？作者选择前驱糖尿病模型来做研究，因为这是2型糖尿病发病机制和预防的关键控制阶段。前驱糖尿病表现为空腹血糖受损、糖耐量受损或 HbA1c异常。作者先验证构建的小鼠模型是否合格：使用HED喂养120天后，小鼠表现出超重和血糖紊乱（图1A至C），这是肥胖和代谢综合征的特征。在40天时，喂食HF而非HS饮食的小鼠显示超重（图1D）。但是，出现了空腹血糖变化和糖耐量受损的体征（图 1E 和 F）。这些结果表明，HF和HS饮食可能诱导不同时间过程的代谢紊乱。作者认为40天喂养的小鼠具有前驱糖尿病特征，因此选定这个阶段开展实验。图1 HF饮食和HS饮食均可诱导小鼠出现前驱糖尿病
2.不同的脂糖比会塑造前驱糖尿病小鼠不同的肠道菌群鉴于HF和HS饲喂在宿主体内表现出一些相似的代谢变化，那么这些饮食是否也相似地重塑了肠道菌群？通过16S测序测定粪便样本，发现饲喂HF和HS饲料的小鼠在门和目水平上菌群存在明显的变化（图2A）。HF组和HS组的Chao1指数显著增加，表明微生物群落丰富度上调（图2B）。虽然Shannon和Simpson指数提示NC和HEDs饲喂的小鼠肠道菌群多样性无明显差异（图2B），但PCoA分析显示样本会按其饮食类型进行聚类（图 2C）。加权UniFrac聚类树分析支持聚类，并显示对照饮食聚类远离两个HED聚类（图 2D）。这些结果表明，不同脂糖比的饮食在前驱糖尿病小鼠中塑造了不同的肠道菌群。图2-1 在前驱糖尿病小鼠中，不同的脂糖比塑造了不同的肠道菌群为进一步研究菌群变化，作者采用LEfSe表征了饲喂NC、HF和HS饮食的小鼠肠道菌群的差异（图2E和F）。总体上，有4个显著不同的门，其中Bacteroidetes（拟杆菌门）在对照组中含量较高，Actinobacteria（放线菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）分别在HF组和HS组中富集，Verrucomicrobia（疣微菌门）在对照组中未检出（图 2E～G）。根据 LEfSe 分析，这些高丰度的分类群可以被认为是潜在的生物标志物（LDA评分> 4.0；p< 0.05）（图2E）。Bacteroidaceae（拟杆菌科）是NC组的潜在生物标志物。Bifidobacteriaceae（双歧杆菌科）和Lactobacillaceae（乳酸菌科）是 HF组的标志物，Verrucomicrobiaceae（疣微菌科）是HS组的标志物（图 2E 和 F）。为进一步了解肠道菌群的重塑，作者使用宏基因组测序观察种水平的变化。PCA分析也揭示了微生物群落也是根据饮食类型进行聚类的（图 2H）。这些结果表明，在前驱糖尿病小鼠中，HF和HS饮食诱导了两种不同的肥胖相关肠道菌群模式。图2-2 在前驱糖尿病小鼠中，不同的脂糖比塑造了不同的肠道菌群
为探索HED饲喂小鼠的菌群功能变化，作者做了宏基因组测序。共检出基因3821个。PCA分析表明HF和HS组的基因图谱接近，但与对照组差异很大，尽管这两组之间的细菌种水平存在显著差异（图2H和图3A）。用热图显示500个丰度最高基因的表达谱，同时用ANOSIM分析相似性（基于Bray-Curtis距离）都表明HF和HS组的基因图谱具有更高的相似性 [R (NC vs. HF) =1、R (NC vs. HS) = 0.815 和 R (HF vs. HS) = 0.296，值越大相似性越低]（图 3B）。HF组和HS组表达最高的20个基因中有16个基因重叠（图3C）。不仅如此，当HF组富集的224个基因与HS组富集的213个基因比较时，发现112个基因是相同的（图3D）。HF组和HS组20个最富集的基因也有重叠（图3E）。然后将这些基因比对KEGG数据库。作者注意到，HF组中富集的大多数基因可在Lactobacillus（乳酸杆菌属）或Bifidobacterium（双歧杆菌属）中发现，而HS组中富集的大多数基因来自Akkermansia（图 3E），HF和 HS组中均有4个基因（K00768、K02114、K03413和K06898）（图 3E）。当考虑前50个富集的基因时，HF组和HS组均发现相同的25个基因，其中17个基因可比对到乳酸杆菌、双歧杆菌和Akkermansia（图3F）。接下来，作者将所有基因分组成通路集，发现在HF组和HS组富集的基因集之间共享61个基因集。根据错误发现率 (FDR) (＜25%) 和/或p值 (5%)，缩小至具有最高标准化富集分数 (NES) 或显著集的20个基因集，两组的相似性似乎更大（图3G）。两组共有的通路主要涉及能量代谢以及脂类和氨基酸的生物合成（图3H）。这些结果表明，HF和HS饮食富集了相似的基因图谱，尽管形成了不同的菌群。虽然HF和HS饮食富集的基因集非常相似，但仍存在一些差异。HF和HS组之间的比较也显示了一些显著不同的基因集，如图3H中的红色条（HF组富集）或蓝色条（HS组富集）所示。HFD优先富集能量代谢和氨基酸代谢相关的基因，HSD倾向于增加核苷酸代谢相关的基因（图 3H）作者主要关注弱极性粪便代谢物。发现在HED饲喂的小鼠中，硬脂酸的比例增加，而 D-（+）-木吡喃糖（D-木糖）、胆甾烷-3-醇（5β,3α）和胆甾-5-烯-3-醇的比例降低（图4A）。KO02030（细菌趋化性）、KO00770（泛酸和辅酶 A [CoA] 生物合成）、KO01230（氨基酸的生物合成）、KO00340（组氨酸代谢）、KO01200（碳代谢）、KO00300（赖氨酸生物合成）和KO02020（双组分系统）的富集似乎与L-天冬氨酸的增加一致。KO00061（脂肪酸生物合成）、KO00561（甘油脂代谢）和 KO00564（甘油磷脂代谢）的富集可能对应于9,12-十八碳二烯酸和硬脂酸的增加（图3H、图4B）。基因和通路的改变与代谢产物密切相关。在HED组降低的1-Acyl-sn-glycerol-3-phosphate酰基转移酶(K00655)和磷脂酸胞苷酰转移酶 (K00981)，可能促成各种脂肪酸和相关脂质的变化（图3H和图4B、C）。L-天门冬酰胺酶 (K01424)、天门冬酰胺合成酶 (K01953) 和天冬氨酸转氨酶 (K00812) 的变化可能是L-天冬氨酸升高的原因（图3H和图4B、C）。木糖异构酶(K01805)下调，将D-木糖转化为D-木酮糖，可能导致D-木糖减少（图3H和图4B、C）。此外，L-天冬氨酸也是各种次级代谢途径（KO01230、KO00240、KO02030、KO00300、KO00770 和 KO01200）的底物，这些次级代谢途径也是富集的（图3H）。5.HED调节的微生物和代谢产物会影响脂质蓄积（功能验证实验）作者接下来探讨了肠道微生物和肠道代谢产物在脂质蓄积中的作用。以秀丽隐杆线虫为模型，观察到Lactobacillus plantarum（植物乳杆菌）在HF、HS和对照饮食中丰度低且没有变化，Bifidobacterium longum（长双歧杆菌）在三种饮食中丰度高但也没有变化。HED组中Bifidobacterium animalis（动物双歧杆菌）出现丰度减少，而Clostridium butyricum（酪酸梭菌）增加（图5A）。与E. coli OP50 相比，在秀丽隐杆线虫中，L. plantarum ZS2058和B. animalis BB-12饲喂会降低脂质蓄积，而 B. longum JCM7053和C. butyricum MIYAIRI 588会促进脂质蓄积（图5A） 。与胆固醇相比，甾体胆固醇-3-醇（5β,3α）和菜油甾醇处理会显著减少脂质蓄积，而α-生育酚处理没有影响（图5B）。作者使用OP9哺乳动物细胞进一步证实了这些结果。L-天冬氨酸、胆甾烷-3-醇（5β,3α）和菜油甾醇处理可抑制罗格列酮诱导的脂肪形成（图5C）。Fabp4、脂联素、Plin1和Cebpα表达增加，提示脂肪细胞分化和脂质蓄积。菜油甾醇会减少所有四个基因的转录。L-天冬氨酸会促进脂联素的表达，但对Plin1和Cebpα的作用正相反。胆甾烷-3-醇（5β,3α）会降低Cebpα表达（图5D）。综合这些结果表明，L-天冬氨酸、胆甾烷-3-醇（5β,3α）和菜油甾醇可能通过不同的机制抑制脂肪生成。6. HED调节的肠道代谢产物会影响RAW 264.7巨噬细胞活化（功能验证实验）巨噬细胞，特别是M1极化巨噬细胞，是肥胖相关慢性炎症的关键介质。因此，作者评价了前述代谢产物在巨噬细胞相关炎症中的作用。使用脂多糖 (LPS) 活化的RAW 264.7小鼠巨噬细胞评价L-天冬氨酸、胆固醇、胆甾烷-3-醇（5β,3α）、菜油甾醇和α-生育酚对细胞因子转录和分泌的影响。L-天冬氨酸增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平，但没有增加成熟蛋白的水平。胆甾烷-3-醇（5β,3α）会在mRNA和蛋白水平限制IL-6的产生。菜油甾醇会显著减少IL-6和TNF-α转录，以及IL-1β和IL-6的生成（图 6）。这些数据表明，胆甾烷-3-醇（5β,3α）和菜油甾醇具有潜在的抗炎作用，以及L-天冬氨酸可能具有促炎作用。图6 HED调节的肠道代谢产物会影响RAW 264.7巨噬细胞活化编者说
本研究结果说明，如果仅使用16S rRNA基因测序来确定肠道菌群对饮食的响应以及与糖尿病状态的关联，会丢失重要的信息。在本研究中，尽管Bifidobacterium（双歧杆菌属）在HED组中富集，但在HED组中，B. longum（长双歧杆菌）没有变化，但B. animalis（动物双歧杆菌）是减少的（图5A）。在功能上，B. animalis会减少线虫的脂质积累，而B. longum则是增强这个过程（图5A）。进一步来说，相比于增加的Bifidobacterium，减少的B. animalis会是更可信的前驱糖尿病标志物。总结一下，属（Genus）水平的变化与种(Species)水平的变化往往是不同的，同在种水平下，不同种之间的变化也不同。在种水平上才能更准确地描述菌群的功能变化。宏基因组测序会比16S测序鉴定出更丰富且更准确的种水平（甚至株水平）的细菌信息，更为重要的是揭示菌群基因功能，而16S测序通常是以讨论属水平的细菌多样性为主（《肠道菌群与疾病因果性的研究策略 | 微生物专题》）。对了，此项研究使用到微生物组分析结果图都包含在我们的医学16S测序报告《医学16S测序报告：为忙碌的医生而准备 | 微生物》和医学宏基因组报告里（《一份正经的宏基因组医学报告应该长这样 | 微生物专题》）。