核酸表观遗传修饰能调控真核生物的基因表达, 对遗传、生长和疾病发生等方面有重要影响[1,2]。近年来, RNA表观遗传修饰研究取得了很大进展[3]。天然存在的RNA分子含有各种化学修饰。目前在RNA分子中共鉴定了150多个结构不同的修饰类型[4]。
几乎所有类型的RNA中均含有修饰。目前在转运RNA (Transfer RNA, tRNA) 上发现的修饰种类最多[5]。核糖体RNA (Ribosomal RNA, rRNA) 是细胞中含量最丰富的RNA, 也含有许多位于不同序列和结构上的修饰类型[6]。除了在这些丰富的非编码RNA (Non-coding RNA, ncRNA) 中发现多种修饰外[7], 近年来研究者在体内丰度较低的RNA类型中也发现越来越多的修饰, 包括信使RNA (Messenger RNA, mRNA) [8]、小核RNA (Small nuclear RNA, snRNA) [9]、核仁小RNA[9]和微小RNA (microRNA, miRNA) [10,11]等。甚至环状RNA中也存在RNA修饰, 如N6-Methyladenosine (m6A) [12]。研究表明RNA修饰在真核生物的生命调控中发挥了重要作用[13]。然而, 由于缺乏合适的检测方法, 目前对很多RNA修饰, 特别是对低丰度的RNA修饰的功能了解甚少[14]。阐明RNA修饰的生物学意义需要能特异性检测、量化修饰核苷并对其分布进行定位的高灵敏度分析工具。近几年, 用于RNA修饰量化和定位的分析方法已取得了很大进展。
RNA修饰的分析方法主要分为RNA修饰的全分析和定位分析两大类。本文总结了这两类分析方法的最新进展, 并讨论了其优点和不足。通过了解每种分析方法的特性, 研究人员可以选择合适的分析方法。此外, 随着技术的进步, 更多新的RNA修饰会被发现, RNA修饰的生理功能会被进一步认识。
1. RNA修饰的全分析
用于RNA修饰全分析的方法主要包括毛细管电泳 (CE) 、液相色谱 (LC) 、液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 、薄层色谱 (TLC) 、荧光标记和免疫检测等方法。RNA修饰的全分析需要酶/化学处理释放RNA组分, 例如核苷酸、核苷或核酸碱基, 随后采用各种分析方法进行检测。
1.1 毛细管电泳法毛细管电泳是一类以毛细管为分离介质、以高压直流电场为驱动力的分离技术, 其原理是基于电场中带电粒子的分离, 可与紫外检测、质谱检测和激光诱导荧光检测等技术耦合。研究表明尿液样品中的修饰核苷可作为潜在的癌症生物标志物。Jiang等[15]开发了毛细管电泳结合紫外检测技术分离和定量尿样中包括修饰核苷在内的10种核苷, 检测限 (LODs) 小于2.0μmol/L。与以往的研究相比, 该方法更简单、快速, 可用于尿样中修饰核苷的量化。最近, Stephen等[16]提出了一种使用毛细管电泳结合激光诱导荧光 (CE-LIF) 分析腺嘌呤核苷 (Adenosine, A) 和次黄嘌呤核苷 (Inosine, I) 的方法。首先使用2, 4, 6-三硝基苯磺酸衍生A和I, 得到三硝基苯基的荧光络合物TNP-A和TNP-I。TNP-A和TNP-I进一步与γ-环糊精形成配合物, 荧光增强约25倍, 最后通过CE-LIF进行检测分析。该法可同时分析和定量大鼠前脑样品中的A和I, LODs分别为1.6、4μmol/L。此外, Khan等[17]报道了一种毛细管电泳结合质谱 (CE-MS) 直接分析生物样品中miRNA的方法。通过CE-MS方法, 不仅能够检测到从B细胞慢性淋巴细胞白血病血清中分离的两种内源性的循环miRNA (isomiR-16-5p和miR-21-5p) , 而且能够实现miRNA修饰的无标记定量。已有研究表明miRNA的序列和内容与某些癌症有关[18], 说明CE-MS方法分析miRNA具有临床诊断的多功能生物检测的应用潜力。虽然CE方法可快速分离分析物, 且能提供良好的分离度, 但稳定性和重现性欠缺。此外, CE方法的样品上样量有限, 限制了其灵敏度, 有待进一步改进。
1.2 液相色谱法液相色谱技术发展比较成熟, 被普遍应用于核酸修饰的分析。通过液相色谱技术检测RNA修饰的方法是基于酶或化学水解产生的RNA组分的色谱分离。若液相色谱对不同的RNA组分无法进行有效分离, 会造成无法对RNA修饰进行定性分析。因此, 基线分离对基于液相色谱的分析方法至关重要。基于液相色谱的方法常用于核苷的早期研究。Desrosiers等[19]使用二乙氨乙基纤维素色谱法结合放射性同位素标记研究来自Novikoff肝癌细胞mRNA中的甲基化。同位素标记的RNA被完全酶解成核苷后, 通过液相色谱分析RNA中甲基化修饰核苷的组成, 并与标准品比对, 鉴定了mRNA中存在的4种2’;-O-甲基核苷, 分别为2’;-O-Methyladenosine (Am) 、2’;-O-Methylguanosine (Gm) 、2’;-O-Methylcytidine (Cm) 和2’;-O-Methyluridine (Um) 。此外, 还在mRNA上发现了m6A。Buck等[20]采用高效液相色谱结合紫外检测 (HPLC-UV) 对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌 (E.coli) tRNA中的29个修饰核苷进行了分析。该方法快速、灵敏且色谱分辨率高。Gehrke等[21]系统地介绍了用于分析RNA核苷组成的HPLC-UV方法, 并开发了3种优化的反相液相色谱系统, 其在分辨率、分析速度和灵敏度上均有改善。优化的方法可从约1μg tRNA中定量31种不同的核苷, 且检测的相对误差均小于5%。基于液相色谱的方法操作简单、重复性好, 能用于RNA修饰的定量分析, 但其定性能力较弱。为提高对RNA修饰的定性分析能力, 液相色谱常与定性能力较好的质谱联用, 从而实现对RNA修饰的准确定性和定量分析, 液相色谱-质谱联用法也是目前RNA修饰全分析的主要研究方法。1.3 质谱分析法质谱分析通过测定分子质荷比实现对样品的分析。与正常核苷相比, 几乎所有的修饰核苷均有相对分子质量上的增加, 因此可运用质谱鉴定和表征修饰核苷[22]。质谱分析法已被广泛用于核酸碱基、核苷和核苷酸的研究[23-27]。在近10多年中, 基于质谱的分析方法和软件开发取得了很大进展, 能提供有关RNA修饰的定性和定量信息。基于质谱的分析方法已被证明是用于发现和鉴定新的RNA修饰最有力的工具之一[28,29]。1.3.1 液相色谱-质谱分析法由于良好的选择性和灵敏度, LC-MS被广泛用于化合物的定性和定量分析[30-35]。基于LC-MS的方法主要是在核苷水平上对RNA修饰进行研究, 因此在分析前需将待测的核酸样品酶解为核苷[36-41]。修饰核苷的鉴定通常基于与标准品的比对或与RNA修饰数据库的比对。Zhao等[42]开发了一种超高效液相色谱 (UHPLC) 与飞行时间质谱 (Time-of-flight mass spectrometry) 联用的方法分析尿液中含有顺式二羟基结构的核苷和其他代谢物。与HPLC相比, UHPLC的分辨率和灵敏度更高, 能检测到更多潜在的修饰核苷。Chan等[43]使用LC-MS分析了牛分枝杆菌BCG (Bacille Calmette-Guérin) tRNA中的修饰核苷, 将目标tRNA酶解成核苷, 再通过多反应监测 (MRM) 模式的LC-MS进行分析。通过与标准品比对鉴定了12个修饰核苷;并与RNA修饰数据库比对, 进一步鉴定了5个修饰核苷。Su等[44]提出了LC-MS结合动态MRM模式定量分析tRNA中修饰核苷的方法。该方法用HPLC对tRNA进行纯化后, 再用反相HPLC分离酶解的核苷, 最后通过动态MRM模式的LC-MS对单个核苷进行鉴定和定量。该方法可在15 min内实现对数微克tRNA中修饰核苷的相对定量分析。Magana等[45]通过液相色谱-离子阱串联质谱法研究了Cu O纳米颗粒对L.sativum中核酸甲基化的影响。通过将在电喷雾离子化中形成的质子结合的二聚体作为MRM定量的前体离子来增强对含胞嘧啶的核苷的选择性。该研究在DNA和RNA中分别发现了13.03%和0.92%的甲基化胞嘧啶。最近, 武汉大学袁必锋课题组开发并建立了一种通过液相色谱-串联质谱 (LC-ESI-MS/MS) 定量分析单细胞中DNA和RNA甲基化的方法[46]。首先建立了一个高效的循环肿瘤细胞 (Circulating tumor cells, CTCs) 捕获系统, 之后在离心管中完成CTCs裂解、核酸酶解、核苷提取一系列步骤, 最后通过LC-ESI-MS/MS进行分析。该方法实现了在单细胞水平上检测5-Methylcytidine (5-mr C) 、m6A和5-Methyl-2’-deoxycytidine (5-md C) 。为进一步提高修饰核苷的检测灵敏度, 特别是低丰度的修饰核苷, 需对样品前处理过程进行优化[47,48]。武汉大学袁必锋课题组制备了毛细管整体柱, 并将其作为在线固相微萃取柱 (SPME) , 建立了一种在线SPME-LC-MS/MS分析修饰核苷的方法[49,50]。结果显示, 所制备的毛细管整体柱对含有顺式二羟基结构的化合物具有优异的选择性, 能成功用于人体尿液中含有顺式二羟基结构的修饰核苷类化合物和核糖类代谢物的系统分析。运用此方法对比了健康人和癌症患者尿液中含顺式二羟基结构的修饰核苷的相对含量, 发现了几种潜在的癌症生物标志物, 从而为癌症生物标志物的发现提供了一个很好的分析平台[51,52]。1.3.2 稳定同位素标记-质谱分析法质谱信号波动或基质效应常引起定量不准确, 可采用稳定同位素标记的核苷作为内标来校正, 以改善定量分析的准确性。Dalluge等[53]使用同位素稀释结合LC-MS定量分析RNA中的二氢尿嘧啶 (Dihydrouridine) 修饰。首先将RNA样品酶解成核苷, 然后加入[1, 3-15N2]-二氢尿嘧啶 ([1, 3-15N2]-Dihydrouridine) 和[1, 3-15N2]-尿嘧啶 ([1, 3-15N2]-Uridine) 作为内标, 最后通过选择离子监测模式的LC-MS对标记和未标记的核苷的质子化分子离子进行分析。然而许多修饰核苷尚无商品化的稳定同位素标记的标准品[28]。为了解决此问题, Deft等[28]采用代谢标记的方法获得稳定同位素标记的修饰核苷, 并将其用作参考标准, 通过非靶向液相色谱-串联高分辨质谱 (LC-MS/HRMS) 对修饰核苷进行检测。该方法使用在含有D-[13C6]-葡萄糖和氨基酸的培养基中生长的重标记和未标记的大肠杆菌分别饲喂秀丽隐杆线虫 (C.elegans) 幼虫。从标记的或未标记的C.elegans中分离总RNA, 并进行LC-MS/HRMS分析。分别鉴定出C.elegans大RNA片段 (大于200 nt) 中的21个修饰和小RNA片段 (小于200 nt) 中的26个修饰, 并发现一些RNA修饰对环境胁迫具有动态响应。Huber等[54]则建立了一种双稳定同位素标记结合LC-MS/HRMS分析RNA修饰的方法, 采用含稳定同位素标记的[甲基-13CD3]-L-甲硫氨酸的培养基培养人类HEK293T细胞, 以代谢产生RNA中13CD3标记的5-mr C及其氧化衍生物;用含有未标记的L-甲硫氨酸和[1, 3-15N2]-胞嘧啶苷 ([1, 3-15N2]-Cytidine) 的培养基培养人类HEK293T细胞, 以代谢产生RNA中15N2标记的5-mr C及其氧化衍生物。随后对酶解产生的核苷进行LC-MS分析。该方法成功在哺乳动物的RNA中发现了5-mr C的第2个氧化衍生物2’;-O-Methyl-5-hydroxymethylcytidine (hm5Cm) , 并定量了其在高等生物体内的含量。1.3.3 化学标记-质谱分析法不同类型的RNA中修饰的类型不同, 且修饰的丰度也不同。生物体内许多RNA修饰的丰度均较低, 传统的LC-MS难以实现对低丰度RNA修饰的灵敏检测。为提高对分析物的检测灵敏度, 研究者建立了化学标记结合LC-MS的分析方法[30,31,55,56,57,58,59]。Wrobel等[60]提出了一种基于化学标记结合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱 (HPLC-ICP-MS) 高灵敏分析甲基化胞苷和其他核糖核苷的方法, 通过在顺式二羟基核糖基团、六价Os (K2OsO2(OH)4) 和四甲基乙二胺之间形成三元复合物使核糖残基标记上六价Os后, 再采用HPLC-ICP-MS检测分析Os标记的核苷。该方法实现了对Cytidine (C) 、Uridine (U) 、5-mr C、Guanosine (G) 的高灵敏分析。当进样量为100μL时, 上述4种核苷的LODs分别为24、38、21、28 pmol/L。武汉大学袁必锋课题组建立了一种氧化衍生化结合LC-MS的新方法检测DNA和RNA中的5-Hydroxymethylcytosine (5-hm C) 和5-Formylcytosine (5-fo C) [61]。该方法用Mn O2将5-hm C氧化为5-fo C, 5-fo C进一步用丹磺酰肼标记。由于丹磺酰肼上的酰肼基团易与5-fo C上的醛基反应, 生成含有易带电的叔胺基团的腙衍生物, 该衍生基团能够提高5-fo C的电离效率, 进而提高了LC-ESI-MS/MS检测5-fo C的灵敏度。使用该方法发现了哺乳动物的RNA中存在5-fo C。武汉大学袁必锋课题组还建立了化学标记结合LC-MS同时测定RNA中5-Methylcytosine (5-m C) 、5-hm C、5-fo C和5-Carboxylcytosine (5-ca C) 的方法[62,63], 通过使用2-溴-1- (4-二乙基氨基苯基) -乙酮标记RNA修饰, 检测灵敏度增加了70~313倍。通过此方法, 除了在哺乳动物RNA中检出5-ca C外, 还发现人的结直肠癌和肝癌组织中5-hm C含量明显低于癌旁组织 (正常组织) , 表明RNA中的5-hm C可能参与了肿瘤形成和发展过程的调控。此外, 使用吉拉德P试剂标记核酸修饰, 武汉大学袁必锋课题组还建立了化学标记结合SPME-UHPLC-ESI-MS/MS法同时灵敏检测DNA和RNA中的6种甲酰化核苷:5-Formyl-2'-deoxycytidine (5-fodC) 、5-Formylcytidine (5-forC) 、5-Formyl-2'-deoxyuridine (5-fodU) 、5-Formyluridine (5-forU) 、2'-O-Methyl-5-formylcytidine (5-forCm) 和2'-O-Methyl-5-formyluridine (5-forUm) [64]。该方法对核苷的检测灵敏度提高了307~884倍, 并在人的细胞和组织中检测到5-forU、5-forCm和5-forUm。1.3.4 离子迁移谱-质谱分析法传统的定性和定量RNA修饰的分析方法依赖于液相色谱和毛细管电泳来减少背景, 在分析前需进行RNA酶解产物的分离[65]。为简化分析过程, Fabris等[66]提出了离子迁移谱-质谱法 (IMS-MS) 对核糖核苷酸混合物进行直接分析。基于IMS-MS的方法提供了一个额外的分离维度, 以便根据迁移率和碎片特征区分分析物。使用IMS-MS, Fabris等成功分析了相似或相同元素组成的核苷酸混合物[66], 并绘制了不同细胞类型和代谢状态的核苷酸修饰谱图[65], 为探索修饰的生物学意义提供了有价值的信息。1.4 薄层色谱法TLC用于分析核苷酸、核苷和碱基已有半个多世纪的历史。基于TLC分析RNA修饰是通过对比相应的对照物的迁移率进行定性, 通过测定斑点强度进行定量。TLC分离可在一维或二维 (Two-dimensional thin layer chromatography, 2D-TLC) 中进行, 后者可以提供更好的分离度, 已被广泛用于分析各种RNA的修饰[67,68]。由于TLC的方法灵敏度较低, 因此需要结合放射性同位素 (如32P) 标记, 通过放射自显影检测提高其灵敏度。通常用核糖核酸酶A (Ribonuclease A, RNase A) 或RNase T1、RNase T2将RNA酶切成寡核苷酸, 再通过T4多核苷酸激酶用[γ32P]ATP标记寡核苷酸的5’ ;末端后, 使用RNase P1将标记的寡核苷酸酶解为核苷酸单磷酸, 最后采用TLC分析32P标记的核苷酸单磷酸。Zhong等[69]使用32P标记的2D-TLC方法在拟南芥mRNA中鉴定了m6A, 且证明m6A的含量与文献报道的动物细胞中含量相似。TLC方法分析RNA修饰, 其特点是成本低、装置简单、无需昂贵仪器、能实现快速分离, 但由于其分析过程较繁琐、涉及放射性标记、准确性有限, 因此常用于定性研究。1.5 荧光标记法除了化学标记外, 荧光标记也能提高RNA修饰的检测灵敏度。Cornelius等[70]使用BODIPY FL EDA标记核糖核苷酸的5’ ;-单磷酸, 开发了一种灵敏分析RNA组分的CE-LIF方法。RNA或寡核糖核苷酸被RNase P1酶解成核苷酸后, 通过CE-LIF检测荧光标记的BODIPY偶联物。使用该方法检测并鉴定了果蝇、人肝、人肾和酿酒酵母RNA中的修饰核苷, 包括I、Xanthosine (X) 、Pseudouridine (Ψ) 和Am, LODs为80~200 pmol/L。该研究表明使用BODIPY FL EDA荧光标记核苷酸结合CE-LIF检测具有高精确度和高灵敏度测定RNA组成的潜力。为提高液相色谱检测DNA甲基化的分析灵敏度, Torres等[71]开发了一种使用2-溴苯乙酮选择性衍生化胞嘧啶并结合反相HPLC荧光分光光度法检测DNA甲基化的方法, 也适用于RNA甲基化修饰的测定。采用2-溴苯乙酮标记后, 5-mr C的LOD可达16.6 fmol, 与LC-MS方法相当。使用该方法, Barrientos等[72]分析了L.sativum RNA中的总体甲基化水平, 并进一步评估了Cd (Ⅱ) 和Se (Ⅳ) 胁迫对L.sativum RNA甲基化的影响。1.6 免疫检测法免疫检测法的基本原理是抗体-抗原的特异性结合。1992年, Reynaud等[73]利用单克隆抗体检测了尿液中5-mr C、N4-Acetylcytidine (ac4C) 、1-Methylinosine (m1I) 、1-Methyladenosine (m1A) 、7-Methylguanosine (m7G) 和Ψ6种修饰核苷。通过特异性的单克隆抗体对修饰核苷进行定性分析;通过竞争性的固相酶联免疫测定法进行定量分析。使用这种基于免疫的方法, 尿液无需处理可直接分析, 且修饰核苷的检测灵敏度在pmol范围内。使用相同的免疫学方法, Sasco等[74]对68例乳腺癌患者尿液中的这6种修饰核苷进行了评估, 发现乳腺癌患者尿液中的m1I和m1A显著高于正常人。Miao等[75]建立了使用斑点杂交技术分析RNA羟甲基修饰的方法, 提出5-hm C存在于小鼠大脑组织的RNA中, 并发现其在1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶诱导的帕金森疾病小鼠模型中含量降低, 暗示RNA中的5-hm C在神经系统疾病上可能发挥着与DNA中的5-hm C相似的作用。Fakruddin等[76]通过基于免疫的检测方法证明了Cdk5rap1酶介导的修饰核苷2-Methylthio-N6-isopentenyladenosine (ms2i6A) 只存在线粒体tRNA中, 而不存在于细胞核RNA中。基于免疫的检测方法简化了样品前处理过程, 缩短了样品前处理时间, 但抗体的高度特异性是此方法用于准确分析修饰核苷的前提条件。更多干货知识尽在联川生物m6A新书。那还有其他方法获得我们的新书吗？好消息：参加我们的首届新型标志物前沿技术与肿瘤精准治疗新进展钱塘论坛（第三轮通知），现场可免费获得新鲜出炉的m6A新书哦。超多大咖和联川生物m6A新书等着你，赶紧点击下方的阅读原文报名参会吧。参考文献：[1] Chen Y, Hong T, Wang S, Mo J, Tian T, Zhou X. 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