宏基因组测序再挖结直肠癌新标志物—细菌基因 | 微生物专题

杂志：Gut Microbes

影响因子：7.823 一区

样本类型及数目：193例粪便样本

测序技术：宏基因组测序（107例） + qPCR验证（60例）

关键词：CRC，肠道菌群

研究背景

越来越多的证据表明，肠道菌群在人类生长发育、疾病免疫等过程中扮演着重要角色。结直肠癌（CRC）在世界范围内具有很高的发病率和死亡率，有侵入性结肠镜检查在普通健康风险评估中并不被广泛接受。因此，非侵入性肠道微生物组（GM）生物标记物在CRC的早期诊断中具有巨大潜力。

在先前的研究中已证实了多个CRC生物标记物，包括 Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus stomatis, Parvimonas micra, 及Solobacterium moorei；但是肠道微生物可能受到多种环境因素的影响，因此作者假设不同地区的CRC生物标记物可能并不一样。

样本准备

不同的民族、饮食、生活环境都可能会影响GM生物标志物的表现。因此，作者在挑选样本时仅对中国重庆地区193例病人，包括98名CRC患者（68名男性和30名女性）和95名健康对照（49名男性和46名女性）（表1）。52位患者及55位相应健康家庭成员的粪便进行了宏基因组关联分析。所有的患者都经医院结肠镜诊断确认。病人样本筛选标准：年龄小于18、大于76岁；结直肠良性肿瘤、或在一个月内抗生素治疗、化放疗及全身糖皮质激素治疗的样本将被排除；健康样本筛选标准：其他肠道疾病患者（包括痢疾，慢性肠炎，炎症性肠病，肠易激综合症，克罗恩病）、代谢性疾病（BMI≥32，糖尿病或营养不良）、长期摄取益生菌或在一个月内进行过全身糖皮质激素治疗的样本均被排除，并要求与患者一起生活至少一年以上。

所有符合标准的患者清晨收集新鲜粪便、血液和尿液，干冰冷冻30min后转如-80℃冰箱保存；对照组样本在医院进行体检时收集新鲜粪便。临床指标包括：（1）血液：血清肌酐、空腹血糖、血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰转肽酶和白蛋白、肿瘤标志物（如癌胚抗原）；（2）粪便：潜血测试、粪便颜色和形状。

在验证上，作者从同一家医院中招募了30名独立的CRC患者和30名健康对照进行qPCR验证（表S2），并通过来自香港地区75位CRC患者和53位健康对照（PRJEB10878）、法国地区53位CRC患者和88位健康个体（ERP005534）已发表宏基因组学数据进行验证。

主图及结果

微生物多样性

与健康人相比，CRC患者的不仅在指标上有所差异，同样在微生物属水平、种水平的多样性上也略有增加（P> .05，图1a）。门水平上，拟杆菌门和厚壁菌门占主导地位，变形菌门略有变化，但是健康组和患病组之间并没有显著差异（校正后 P> 0.05，图1b）。基因数目上，两组之间的差异不明显（P> 0.05，图1c）。

与健康家庭成员相比，CRC患者在属水平上， Coprobacillus、伯克氏菌属 (Burkholderia)、卟啉单胞菌属 (Porphyromonas)、副球菌属 (Paracoccus)、厚壁菌属 (Peptoniphilus)、聚球藻属 (Synechococcus) 和 Cyanothece显著富集（校正后的P <.05，图1d，表S5）；在健康组中，Roseburia inulinivorans、Clostridium ramosum、普氏菌 (Porphyromonas gingivalis)、具核梭杆菌 (F. nucleatum)、 Gemella morbillorum显著富集（校正后的P <.05，图1d，表S5）。

标记基因鉴定

通过将CRC患者的GM与健康个体的GM进行比较，作者首先确定了22个与CRC密切相关的微生物候选标记基因。进一步对这些基因进行归类及注释，包括样本来源、微生物注释及功能注释（详见表S6, 图2a）。ROC曲线表明，这22个候选基因显着区分了CRC病例和健康家庭（ROC下面积（AUC）= 0.998，95％CI 0.993-1.000）。这22个候选基因在补充的46个CRC患者和40个随机挑选的健康样本中同样具有筛查高敏感度。

在香港和法国队列的CRC患者中，这22种生物标记基因中的20种倾向于积累，而其余两个基因在健康对照组中富集（图2a），与重庆队列相似。ROC曲线显示出对香港（AUC = 0.811，95％CI 0.715-0.907）和法国（AUC = 0.859，95％CI 0.773-0.944）人群的CRC患者进行分类的生物标志物基因具有很高的敏感性，但是不不同生活区域和饮食习惯的人群进行CRC筛查时，精确度会有所下降（图2b）。

CRC筛查评估

为了弄清楚重庆地区的CRC生物的标记物在面对的不同地区队列CRC筛查时精确度下降的原因，作者进一步比较了的三个队列中所有微生物的分布情况。

非度量多维尺度分析（NMDS）分析显示，同一区域中的微生物样品聚集在一起（图3a）。此外，与法国队列相比，重庆的微生物样品与香港的微生物样品更为相似（图3a）。进一步的分析表明，重庆队列中的健康人群的微生物多样性最低，而法国队列中的健康人群的微生物多样性最高（图S3a，校正后的P <0.05）。在三个队列中，拟杆菌属占主导地位，而普雷沃菌属在CQ队列中代表了第二高的丰度（图S4，表S8）。此外，与其他两个队列相比，这两个优势属在重庆队列中的富集程度更高。作者推测，地区对于微生物多样性的影响高于CRC因素。

进一步作者通过qPCR在重庆队列中验证了三个生物标记物基因（根据其对CRC患者筛选分类贡献度及准确度挑选）。结果显示，CRC患者和健康对照者之间两个生物标志物基因（来自Coprobacillus 和 C. symbiosum）的相对丰度显着不同（校正后P <0.05，图4a）。

密度曲线说明了CRC病例和健康对照之间两个生物标记基因（来自Coprobacillus gene 8122329 和C. symbiosum gene 3742340）相对丰度的差异分布（图4b）。但是，来自 Fusobacterium的 gene 5053929 并没有出现明显的分布差异（图4b）。因此，在后续的分析中被剔除。根据随机森林算法，60例重庆地区的独立样本ROC曲线分析表明，gene 8122329能够很好地筛查CRC患者（图4c，AUC = 0.930，95％CI 0.904-0.955）。若同时将两者做为标记物，AUC值略有增加（图4d，AUC = 0.935，95％CI 0.883–0.987）。

小编时刻

乍一看，文章的主题其实真的不新，因为科学研究总会从相互有联系的假设下展开，例如以下几篇报道：

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CRC作为世界上死亡率很高的恶性肿瘤，积累了丰富研究基础，对应的也使该领域的文章发表难度提高，本研究仍能够在2020年发表在不错的期刊。小编认为主要有以下几点：

1. 样本收集与研究目的一致，且尽可能根据条件严格筛选，因此结果比较中，可以更好的讨论因素（比如地域）对应CRC病变的影响；同时，为了进一步减少生活习惯或饮食所导致的微生物多样性不同，作者在筛选入组人员过程关注家庭来源的对照。

2. 探测手段使用宏基因组测序，进而在生物标记物上关注基因层面；并展开讨论。

3.不同的数据进行校验，在验证候选标记物中，作者通过校验其他报道的数据，同时通过qPCR对独立样本进行验证。

思路再拓展

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主要参考文献

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Wong SH, Kwong TNY, Chow TC, Luk AKC, Dai RZW, Nakatsu G, Lam TYT, Zhang L, WuJCY, Chan FKL, et al. Quantitation of faecal Fusobacterium improves faecal immunochemical test in detecting advanced colorectal neoplasia. Gut. 2016;66:1441–1448. PMID: 27797940. doi:10.1136/gutjnl-2016-312766.

LiangQ, Chiu J, ChenY, HuangY,Higashimori A, Fang J, Brim H, Ashktorab H, Ng SC, Ng SSM, et al. Fecal bacteria act as novel biomarkers for noninvasive diagnosis of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 2017;23:2061–2070. PMID: doi:10.1158/1078-0432.CCR-16-1599.

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