170例宏基因组数据揭示肠道菌群与强直性脊柱炎的关系 | 微生物专题

发表期刊：Journal of Autoimmunity

影响因子：7.543

发表时间：2019

关键词：强直性脊柱炎、宏基因组、肠道菌群、诊断标志物

实验方法：宏基因组测序

研究背景

强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)常被称为是“不死的癌症”，是一种常见的慢性炎症性疾病，影响骶髂关节和脊柱，伴有或不伴有周围性关节炎等全身症状，严重者可发生脊柱畸形，严重影响工作和生活。著名歌手周杰伦也是强直性脊柱炎患者。其患病率在我国为0.3%左右，男女比例约为2-3:1，发病年龄通常在13到31岁，40岁以后及8岁前发病者少见。AS的病因尚不清楚，遗传风险因素被认为是发病机制之一。此外研究表明，肠道菌群失调涉及多种炎症性疾病，包括炎症性肠病（IBD）、类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）及强直性脊柱炎（AS）。本研究采用宏基因组测序对治疗前后AS患者以及健康对照组的粪便进行检测，深入解析AS患者肠道菌群的组成与功能。 
实验设计

对85例未经治疗的AS患者和62例健康对照组的粪便进行宏基因组测序分析，从AS患者中收集23例治疗后的粪便进行比较。入组条件：入组前三个月未服用抗生素或益生菌，不患有胃肠道疾病、慢性或急性感染或严重基础疾病（如急性冠状动脉综合征、慢性肾功能衰竭和肿瘤）。
样本类型

粪便样本
研究结果

1.强直性脊柱炎患者肠道微生物组成及功能紊乱
利用粪便宏基因组数据，比较AS患者与健康对照组之间的肠道微生物物种组成。橙色代表AS患者丰度高，蓝色代表健康对照组中丰度高，在初诊患者中，发现14个Metagenomics species（MGS）升高，94个MGS降低(图1)。在富集的MGS中，有7个带有注释，分别为Bacteroides coprophilus DSM_18228, Parabacteroides distasonis,ATCC_8503, Eubacterium siraeum V10Sc8a, Acidaminococcus fermentans VR4_DSM_20731-mgs0807 和Prevotella copri CB7_DSM_18205。在23例治疗后的患者粪便样本中，发现Prevotella copri CB7_DSM_18205在治疗后有降低，而Enterococcus faecium E980 和 TX0133a01等物种，在治疗后丰度升高（图2a)。23例治疗后的患者分为6例仅使用NSAIDs治疗和17例联合TNFi/DMARDs抑制剂治疗，在接受TNFi/DMARDs治疗的患者中，Prevotella copri CB7_DSM_18205的恢复情况比仅接受NSAIDs治疗的患者更显著（图2b）。图1图2a
图2b在功能分析方面，进行KEGG通路富集分析，对照组中主要富集的是磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸转移酶(PTS)系统和腺苷结合盒转运蛋白，而AS患者富集主要涉及三种途径，包括氧化磷酸化和脂多糖生物合成和糖胺聚糖降解（图3）。图32.  肠道微生物与不同富集类群的临床指标和诊断模型的关系在所有的临床指标检测中，使用PERMANOVA 分析发现贝氏强直性脊椎炎活性指数(BASDAI)是AS患者主要疾病活动指数，与AS患者肠道菌群的相关性最强(P=0.034)。还发现AS患者富集的 Acidaminococcus fermentans VR4_DSM_20731 与BASDAI指数呈正相关，而Parabacteroides distasonis ATCC_8503 与BASDAI指数呈负相关。Acidaminococcus fermentans VR4_DSM_20731也与周围关节炎表型相关。基于肠道物种丰度建立了一个随机森林模型作为诊断分类器，用于区分为患者和健康对照组，随机选取70%的样本作为训练组(AS样本 59例；健康对照样本43例) ，其余30%组成测试组(AS样本 26例；健康对照样本19例)，并绘制ROC曲线，AUC值分别为89.7% (CI 83.7%–95.6%) 和 82.6% (CI 68.5%–96.6%) ，其中18个MGS markers被识别为该分类器的关键markers。重要性级别由mean decrease accuracy 值表示,橙色代表AS患者中丰富，蓝色代健康组更丰富（图4b)。结果显示Gordonibacter pamelaeae 7–10-1-bT_DSM_19378 在AS肠道中减少的物种中预测效果最好，而Bacteroides coprophilus DSM_18228 在AS富集的物种中预测效果最好（图4b)。图4a图4b
3.  不同炎症性关节炎的比较分析
为了检验不同炎症性关节炎中肠道菌群的一致性和差异性，作者使用了发表的类风湿性关节炎(57 RA patients，95 controls) 和白塞氏病(24 BD patients，52 controls )的宏基因组数据，与本研究中的AS数据使用相同方案进行分析，再次建立了随机森林模型，以确定是否存在针对不同炎症性关节炎的特异性生物标志物（图5），通过微生物标记聚类不同的炎性关节炎，发现AS和RA之间的关系比其他组更密切，而这恰好与它们都是炎性关节炎的临床性质一致。图5三种不同炎性关节炎的通路富集分析显示，糖酵解是RA和BD中最丰富的途径，氧化磷酸化和柠檬酸循环途径在AS患者更为富集。AS和RA肠道菌群中糖胺聚糖降解途径及其他糖胺降解途径明显增加。
4. AS富集的微生物肽触发IFN-γ生产能力为实验证实AS和肠道微生物之间的潜在关系，作者将AS肠道中上调的物种（Q<0.1）的蛋白质序列与IEDB（免疫表位数据库3.0）中的自体表位进行匹配，后者被证明通过AS患者的抗原抗体反应刺激CD8⁺ T细胞反应。三种细菌肽与AS自体表位的相似度超过80%。鉴于IFN-Ã的生产通常作为CD8⁺T细胞活化的指标，作者进行了ELISPOT实验，检测这些肽诱导的PBMCs分泌IFN-Ã的情况。在Bacteroides fragilis 3_1_12的“HIGQPGVIG”刺激下（模拟II型胶原的“ARGQPGVMG”），只有具有HLA-B27的AS患者的PBMCs而不是来自健康受试者的PBMCs表现出过度的IFN-γ生产能力（图6）。图6
研究结论

研究发现AS患者中富集的菌种Bacteroides coprophilus, Parabacteroides distasonis, Eubacterium siraeum, Acidaminococcus fermentans 和Prevotella copri.，随机森林模型筛选的AS肠道微生物特征具有较高的鉴别准确率，可以作为AS患者的肠道标志物，富集的通路包括氧化磷酸化、脂多糖生物合成和糖胺聚糖降解。此外在AS患者中还发现了Bacteroides fragilis和III型分泌系统等与自身免疫相关的特征，最后，体外实验证明AS患者肠道菌群中部分富集的细菌多肽可模拟II型胶原，促进IFN-γ的分泌。

参考文献Zhou C, et al. Metagenomic profiling of the pro-inflammatory gut microbiota in ankylosing spondylitis[J]. Journal of Autoimmunity, 2019: 102360.
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