如今单细胞热度不减，本文将简单剖析两篇2020年最新发表的单细胞高分文章，帮大家梳理下几个实验设计中几个关键细节，从而更加合理的“烧钱”。
几年前，单细胞测序更多是处于一个开荒的状态，各类细分领域纷纷抢占山头，只要样本测了单细胞，几乎CNS杂志都在向你招手。但是从去年开始到今年，这类文章越来越少了，文章挖掘程度也越来越深刻。
我们首先来看下单细胞测序的文章类型，大家可以观察下PDF文件的左上方和右上方，都有Article、Resource、Letter等字样。其中Resource属于资源类文章更多会侧重于纯测序。Article这类研究性论文则从整体上逻辑会更完整，包括测序和后期验证一整套框架体系。
下面我们就来看下2020年1月和2020年3月分别在Cell和Nature的子刊——Immunity和Nature Cell Biology上发表的两篇论文，来向大家展示两种不同的论文类型有什么区别。
我们先来简单看下发表在Immunity上名为Immune Landscape of Viral- and Carcinogen-Driven Head and Neck Cancer的头颈癌单细胞测序Resource论文。已知包括HPV、酒精、吸烟等因素在的多种因素均会引发头颈癌，从整体上来说HPV阳性病人会比HPV阴性的病人预后更好但具体原因不详，且只有不到30%的病人能从PD-1/PD-L1治疗获益。所以作者想通过单细胞测序，研究头颈癌病人的免疫微环境，从而为治疗提供靶点和依据。
作者从总计18名HPV+病人原发灶、8名HPV –病人原发灶、5例扁桃体对照样本、6例健康人PBMC样本进行单细胞测序。在这一步中，作者利用单细胞测序数据，重新开发算法将单细胞测序数据转化成Pseudobulk expression matrices，也就是普通转录组数据。利用这个假转录组数据，揭示了PBMC和TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）样品之间基因表达的巨大变化，并提出了与HPV–和HPV + TIL之间的差异性浸润和转录状态相关的子结构。另外，更加脑洞大开的是，利用物理学中温度逐级降低的退火概念，重新开发单细胞聚类算法DRAGON，提供了聚类生成的统计学原则，通过逐步降低期望值/最大化来逐步减少混乱，避免了局部极小值。最后细胞聚类分析揭示了HPV–和HPV+ TIL之间的B细胞，骨髓细胞和常规CD4 +（Tconv）细胞之间存在巨大差异（图1F）。相反，HPV–和HPV + TIL之间的CD8 +T细胞和CD4+调节（Treg）细胞更为相似.接下来作者对CD8+ T细胞、CD4+的Tconv细胞、CD4+ Treg细胞、B细胞以及骨髓细胞分别进行亚聚类分析，重新在这些细胞中划出更小的细胞亚群。结果显示，来自HPV–和HPV + TIL的CD8 + T细胞的轨迹在很大程度上重叠。拟时序分析显示分化末抑制剂的相关受体蛋白如LAG3、CTLA4、PD1、HAVCR2（TIM3）等表达更高。而针对CD4+Tconv和Treg而言，拟时序分析显示CD4+Tconv在HPV+和HPV–样本中分化轨迹差异较大，而Treg则相似，并且在分化过程中与IFN相关信号和TNFR家族信号相互相关。所以Tconv和Treg两者在分化轨迹上并不相同。对HPV–与HPV +头颈癌的肿瘤微环境中B细胞的分析得出的结论是，通过HPV +头颈癌的生发中心反应，生发中心B细胞存在于各个发展阶段，而B细胞的数量较少且为非生殖细胞HPV–HNSCC中的中心状态。分化轨迹分析表明HPV+和HPV–在DC1上分布不同。作者最后在HPV+和HPV–头颈癌样本的中对受体蛋白和配体蛋白的互作进行了生信分析，为此还专门开发了CellTalker这个R包。因此作者通过这个R包发现了许多与健康人不同且专属于肿瘤微环境中独有的蛋白互作事件。最后作者通过FISH、TCGA的数据挖掘以及Bulk转录组等多种手段，验证单细胞测序数据中与效应TFH相关的差异表达基因。综上所述，作者确定了跨组织切片的独特免疫浸润模式，使用自己开发的R包CellTalker在HPV+和HPV–头颈癌中的单细胞测序数据鉴定相互事件，并发现TFH富集的转录特征与改善的无进展生存期（PFS）相关。接下来我们来看下这篇2020年3月份刚刚出炉的这篇名为Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing的三阴性乳腺癌的单细胞测序文章，发表在了有小Cell之称的Nature Cell Biology。主要研究乳腺癌转移机制。首先作者构建了三种不同的三阴性乳腺癌PDX模型，分别命名为HCI001、HCI002和HCI010。这对于确定细胞异质性在肿瘤转移中的角色至关重要。与许多乳腺癌患者一样，在这些PDX模型中转移进展缓慢且偶发，大多数动物在肺和淋巴结中表现出分散的微转移，这使人们能够研究与微转移有关的早期基因在mRNA的转录水平发生的变化。所以在下一步，作者使用流式细胞仪把CD298和MHC-1阳性的转移细胞分离出来，对来自PDX小鼠的肺、淋巴结和原发灶的癌细胞进行单细胞测序。
TSNE聚类分析表明PDX模型显示出实质性的肿瘤内和肿瘤内异质性，并且可以在原发性肿瘤和微转移中鉴定出不同的癌细胞群。这揭示了实质性的肿瘤间异质性，这与先前对恶性细胞的大量研究和单细胞测序研究一致。
作者鉴定了100多个与转移相关的差异基因包括几种热激蛋白和细胞角蛋白基因。之后把这些基因进行生存分析，确定了15个高风险基因（与之前已确认的20个与肿瘤转移复发相关），进一步提高了预测患者复发的能力，警示风险增加三倍。使用Logistics回归模型计算发现，只有罕见的原发性肿瘤细胞表达PHLDA2可作为鉴定转移性播种的潜在驱动因素和生物标志物的资源，以预测乳腺癌患者的转移进程。
对差异基因进行GO富集分析表明，OXPHOS、糖酵解和线粒体复合物相关的27个基因差异表达且富集。作者还评估了37种不同代谢途径相关基因，发现在37个途径中的33个途径，有70％以上的基因被检测到。接下来除了对原发灶和转移灶的差异代谢分子进行研究外，还用PCR验证了线粒体相关基因，并对PDX模型中原发灶和肺转移样本中的细胞的线粒体相关基因进行染色以鉴定存活的人细胞并评估相对于线粒体质量的线粒体膜电位。这些数据与转录组分析相结合，有力地表明微转移酶利用较高水平的OXPHOS进行细胞代谢。流式细胞仪分选PDX模型的原发灶和肺转移中的细胞后，进行代谢组学分析。这类样本本身代谢物尽管鉴定数量不多，但仍表明转移灶细胞中富马酸盐和苹果酸差异较大。这2个代谢物是CAC的中间产物，并被送入OXPHOS。另外转移灶的细胞中琥珀酰肉碱含量也显著提升，但丙酮酸或乳酸没有差异。另外转移灶细胞中氨基酸代谢增加。这些数据表明，转移细胞显示出独特的代谢特征，其中包括可能会增加OXPHOS含量的几种代谢物。通过寡霉素（一种OXPHOS的高度选择性抑制剂）处理MDA-MB-231细胞和小鼠T41细胞并注射到PDX模型中观察肺转移能力。结果表明，OXPHOS对于促进转移早期事件很重要，进一步确立了OXPHOS在介导肺转移中的作用。3Resource和Article单细胞测序文章的区别总结Resource的文章通常都偏重于测序篇幅较大，而Article文章更加专注在整个行文逻辑的完整。我们发现第一篇Immunity的文章中，单细胞测序以及生信分析几乎占据了80-90%的篇幅对临床意义只是在文末进行了点题。而第二篇NCB除了在论文前中部分就挖掘了临床意义外，在后期更加聚焦到某些具体参与线粒体能量代谢与糖酵解的基因，并进行了后期验证。
所以我们总结下来，课题组除了拥有充足的经费外，还需要有完整的细胞生物学、动物平台等硬件设施。另外课题思路的创新性必不可少，例如这篇头颈癌的文章中除了烧钱测了很多例单细胞外，算法上的改进也是文章中的一大亮点。实验背后大家看不到的阴影事实上也会对大家产生误导，很多文章背后真实测序样本数会远远比文章中大家看到的要多。比如论文中显示测了30例病人，实际上测序的病人数超过50例也是有可能的。这种额外开销也需要考虑在内。Article类的文章本身一定要弱化单细胞测序，要更加聚焦在通过单细胞测序数据的挖掘而展开的后续内容。例如这篇关于三阴性乳腺癌的文章中，作者首先确定了差异基因中与复发转移高度相关的预后biomarker基因——PHLDA2。之后继续聚焦在线粒体相关基因OXPHOS以及代谢途径中的糖酵解这条pathway，后期配合动物验证，整篇文章显得非常立体饱满。