客户文章 | miR-4510靶向APOC2抑制胃肠道间质瘤

刊登日期：2020年1月

发表杂志：Journal of Cellular Physiology

影响因子：4.522

研究机构：山东省立医院

联川提供：miRNA测序

摘要

研究证实，胃肠道间质瘤（GIST）中microRNAs(miRNAs)的表达会出现失调的现象。本研究中，作者旨在确定GIST中差异表达的miRNA，并探讨GIST细胞中差异miRNA的功能机制。作者通过高通量测序检测了6对GIST癌症组织和癌旁组织中差异表达的miRNA，并通过RT-PCR在64对GIST癌症组织和癌旁组织中对差异miRNA进行了验证。作者发现，与对照组相比，GIST癌症组织中miR-4510的表达明显下调。萤光素酶报告实验证实载脂蛋白C-II（APOC2）为miR-4510的靶基因。miR-4510过表达会抑制APOC2 mRNA和蛋白的表达。另外，miR-4510过表达会抑制GIST细胞的增殖，迁移和侵袭。miR-4510过表达也会抑制AKT和ERK1 / 2的磷酸化，降低基质金属肽酶2（MMP2）和MMP9的表达。通过敲低APOC2模仿miR-4510的过表达作用。进一步研究证实，APOC2在GIST癌症组织中明显上调。这些结果表明，miR-4510下调可通过增加APOC2表达来促进GIST的生长，侵袭和转移。
背景介绍

胃肠道间质瘤（GIST）通常表现为胃肠道的间充质肿瘤。在超过80％的GIST中发现了c-KIT和血小板源性生长因子受体（PDGFRA）的激活突变，从而触发GIST的生长。大约10%的GIST没有c-KIT和PDGFRA的突变，这些被称为野生型WTWTGIST。多达数儿童GIST和约10-15%成年人GIST为WT GIST。到目前为止，手术切除是GIST的主要治疗方法。但是，超过50%的患者随后发生了局部复发和远处转移，从而导致不良预后。靶向酪氨酸激酶c-KIT的伊马替尼辅助治疗可改善c-KIT和PDGFRA突变GIST患者的手术预后，但对WT GISTs效果不佳。因此，有必要探索GIST发展的新分子机制。MicroRNA（miRNA）是一类长度为18-25个核苷酸的短的非编码RNA，可通过与靶向信使RNA（mRNA）的3’ UTR结合来调节基因表达。miRNA广泛存在于肿瘤增殖，侵袭和转移过程中。最近，miRNA已被证明对GIST的发展和进程至关重要。例如，在KIT阳性的GIST中，miR-221和miR-222的表达显著下调，这两种miRNA的过度表达可通过靶向KIT抑制GIST-T1细胞的增殖。miR-374b可通过抑制磷酸酶和张力蛋白同源物促进GIST细胞增殖。与邻近对照组织相比，GIST中miR-182表达显著升高，miR-182过表达可通过抑制肿瘤抑制因子cylindromatosis(CYLD)表达增加GIST-T1细胞的增殖和迁移。这些结果表明，microRNA的失调在GIST细胞的生长，迁移和侵袭中起关键作用。本研究中，作者发现GIST癌症组织的miR-4510表达低于癌旁组织。miR-4510过表达可通过靶向载脂蛋白C-II（APOC2）抑制GIST-882细胞的增殖，迁移和侵袭。进一步的研究发现，GIST癌症组织中的APOC2表达高于邻近正常组织。这些结果说明，miR-4510下调可能通过增加APOC2表达来促进GIST的进展。
结果

图1
作者在6对来自同一类型癌症病人的GIST癌症组织与癌旁组织中进行miRNA测序，检测miRNA的表达差异。一共发现了117个差异miRNAs，其中5个miRNAs显著上调（p<0.05），15个miRNAs显著下调（p<0.05）。接着作者对差异miRNA所对应的靶基因进行了GO和KEGG富集性分析。图2
GIST癌症组织中miR-134-5p、miR-382-5p、miR-323b-3p、miR-409-3p、miR-1185-1-3p、miR-4510和miR-3187-3p显著下调，miR-29b-1-5p显著上调。并且作者在64对GIST癌症组织和癌旁组织内对以上8种miRNAs的表达进行了RT-qPCR验证。发现与对照组织（GIST-N）相比，GIST癌症组织（GIST-T）中miR-4510、miR-323b-3p和miR-409-3p显著下调，而miR-29b-1-5p显著上调。但是miR-134-5p，miR-382-5p、miR-1185-1-3p和miR-3187-3p的表达在两种组织之间没有显著差异。表1对miR-4510的表达与临床病理参数进行关联分析。发现miR-4510的表达与年龄、性别和突变状态之间无显著关联。但是，miR-4510的表达与肿瘤位置、肿瘤大小、有丝分裂和风险分类显著相关。图3

阴性对照（NC），miR-4510或anti-miR-4510分别转染GIST-882和GIST-T1细胞。与NC相比，miR-4510过表达会抑制GIST细胞的增殖，而anti-miR-4510则会加速GIST细胞的生长。流式分析证实，与NC组相比，miR-4510过表达增加了GIST细胞凋亡，而anti-miR-4510减少了GIST细胞凋亡。进一步的研究发现，miR-4510的过表达会抑制GIST细胞的迁移和侵袭。这些结果说明，GIST癌症组织中miR-4510下调可能有助于GIST细胞的增殖，迁移和侵袭。图4
通过Targetscan软件预测miR-4510的靶向基因，发现在APOC2的3'-UTR共有6个miR-4510结合位点。将这些序列构建pMIR-APOC2-Luc质粒，并分别和野生型miR-4510（miR-4510 WT）或突变型miR-4510（miR-4510 MT）共转染 HEK293细胞。发现miR-4510 WT荧光素酶活性降低，而miR-4510 MT荧光素酶活性未受影响。miR-4510或anti‐miR‐4510转染GIST-882细胞72h后，RT-PCR检测发现miR-4510的过表达不仅抑制了APOC2 mRNA和蛋白表达，还减少了培养基中APOC2的分泌。这些结果证明，APOC2是miR-4510的靶基因。图5APOC2敲低实验发现，敲低APOC2可抑制GIST细胞增殖，迁移和侵袭，这与miR-4510过表达的作用相似。表明miR-4510可能通过抑制APOC2表达控制GIST细胞的增殖，迁移和侵袭。图6
作者为了确定miR-4510和APOC2在GIST细胞中的功能机制，检测了miR-4501过表达和APOC2敲低对GIST细胞中ERK1 / 2和AKT磷酸化以及MMP2和MMP9表达的影响。结果表明，miR-4510过表达会显著降低ERK1 / 2和AKT的磷酸化，并抑制MMP2和MMP9的表达，这与APOC2敲低的效果一致。这些结果表明，miR- 4510可能通过抑制APOC2表达来调节ERK1 / 2和AKT的磷酸化以及MMP2和MMP9的表达。图7最后，作者用WB和RT-PCR实验检测了APOC2在组织中的表达，发现GIST癌症组织中APOC2表达高于癌旁组织。表2APOC2表达与临床病理参数关联分析发现，尽管APOC2表达与年龄、性别和肿瘤位置之间没有显著关联，但APOC2 表达与肿瘤大小、有丝分裂、突变状态和风险分类显著相关。这些结果表明，APOC2上调可能促进了GIST的进展。

总结

综上，作者证实GIST癌症组织与癌旁组织相比，miR-4510表达显著降低，APOC2表达显著升高。进一步研究证实，APOC2是miR-4510的靶基因。miR-4510过表达会够抑制GIST细胞的增殖，迁移和侵袭，并阻断AKT和ERK1 / 2的磷酸化及MMP2和MMP9的表达，类似于APOC2敲低。这些结果说明，miR-4510下调可通过增加APOC2表达来促进GIST的生长，侵袭和转移。相关阅读用户文章&nbsp;PNAS-降解组揭示银杏长寿机制