miRNA-降解组常规研究思路示例：microRNA在低温存储甘薯中的调控作用

题目：miRNA-降解组常规研究思路示例：microRNA在低温存储甘薯中的调控作用期刊：Scientific Report影响因子：4.011发表时间：2017年

一、研究背景

甘薯是一种全球重要的经济作物,在我国,约有1/3的甘薯产量受到低温贮藏的影响，大大降低了利用率。因此，研究甘薯块根发育和贮藏的分子机制非常重要。

对甘薯的miRNA及其诱导的mRNA降解片段的测序是一种极为有效的方法，用于研究miRNA对甘薯抗冷害的作用。相比于动物，在植物中miRNA诱导基因剪切降解的方式会更为普遍。降解组测序正是利用高通量测序技术结合生物信息学手段对这些mRNA降解片段进行大规模鉴定，进而鉴定miRNA调控靶基因的技术。

二、材料与方法

存储：分两组，第一组14°C下储存(ATS)；第二组4℃下储存(LTS)，两者的相对湿度均为85%。

取样：连续5周取样，每周7个块根的组织混合成一个生物重复,生物学重复n=3。

处理：对两个组 1~5周的样品进行块根的生理指标测定(丙二醛，淀粉，蔗糖，POD，SOD)，取第四周的样本进行小RNA和降解组测序。

图一 本次实验流程

三、具体实验(甘薯的小RNA和降解组测序)

1.甘薯的生理活性和抗冷害酶的活性测定

甘薯块根分别在4°C(低温贮藏)和14°C(适宜温度贮藏)下贮藏5周。4周时，LTS(低温贮藏)结节内部组织变暗，而ATS(适宜温度贮藏)无明显差异

处理4周后，LTS和ATS的SOD活性、POD活性和MDA含量差异显著；因此检测第4周冷藏处理的样品中miRNA的表达。

2. 甘薯sRNA组的测序

a.序列长度分布的统计

长度分别为22和24个核苷酸的小RNA是大部分冗余序列(图A)，去冗余的序列长度分布表明24个核苷酸是最丰富的序列(图B)，符合植物的miRNA的长度分布

b. 甘薯中已知和新的miRNAs的鉴定结果

鉴定出190个成熟的miRNAs   预测出191个新的miRNA

c. 甘薯中已鉴定的miRNA与其他物种的保守性分析

X轴表示miRBase中的物种名称, Y轴是miRNAs的计数.红色条形图显示miRBase中物种的miRNA数量，蓝色条形图显示在甘薯和近源物种中鉴定的miRNA数量

3.降解组对甘薯miRNA的靶标验证

a.mRNA对应的miRNA预测及鉴定结果统计

在ATS文库中，有189对特有的miRNA及其靶标，其中包括141个转录本，被94个miRNAs靶向；LTS文库中159对miRNA及其靶标是特有的，包括79个miRNAs靶向的126个转录本。

4.QRT-PCR验证已识别的miRNAs和靶标

实验选取14个已知的miRNAs和2个新的miRNAs；线性回归分析[(测序值)=a(qRT-PCR值)+b]发现测序数据与qRT-PCR值呈正相关，相关系数为0.8788；qRT-PCR表达结果与miRNA测序结果相似，并支持miRNA测序结果；进一步验证miRNAs与其相应靶标在低温处理过程中的关系，对随机选择的三个miRNAs及其靶标进行了qRT-PCR分析，如下图:

miRNAs(如miR169G_1ss7AG、miR166a-3p_1ss21CA和MIR172a-3p_L+1R-1)的表达与其靶基因(如NFYA1/NFYA3、ATHB-15和XRN4)呈负相关，表明miRNAs调控甘薯贮藏期间对低温处理的反应。

四、低温胁迫下miRNA调控网络

miRNAs及其靶基因可能共同调控MeJA依赖性信号通路、ROS应答通路、ABA依赖性通路、冷应答基因、病毒抗性以及花青素和RNA代谢。

五、总结

总共鉴定了190个已知的microRNAs和191个新的miRNAs，84个已鉴定的miRNAs以428个转录本为靶标，并鉴定了26个在低温胁迫和对照条件下差异表达的miRNAs。最后qRTPCR也证实了这些miRNAs及其靶标的表达。

对小RNA和降解组测序的综合分析表明，miRNA介导的SA(水杨酸)信号通路、ABA(脱落酸)依赖型信号通路和ROS(活性氧)的反应通路参与了甘薯在贮藏过程中对低温胁迫的响应。

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