肠道菌群在调节宿主代谢中起重要作用。此前的研究发现，与健康个体相比，糖尿病前期与II型糖尿病个体的肠道微生物组成存在差异，在不同年龄和种族的人群中报告了与疾病相关的独特微生物特征。然而，诸如抗糖尿病药物治疗等混杂因素妨碍了病情发展过程中的肠道菌群变化的鉴定。
发表期刊：EBioMedicine
发表时间：2019
影响因子：6.680
研究内容：糖尿病前期患者与未治疗II型糖尿病患者的肠道菌群组成与功能差异，了解肠道菌群与宿主之间的相互作用。
实验方法：宏基因组测序+宏蛋白质组定量
从苏州当地社区招募到97名糖耐量正常（NGT）的中国成人，80名糖尿病前期患者（Pre-DM）和77名未经治疗的2型糖尿病患者（TN-T2D）。所有纳入研究的254位患者均未报告抗糖尿病治疗，但纳入了患有高血压，血脂异常或使用药物治疗这些疾病的患者。粪便样本保存在-80 ℃的2 mL容器中用于宏基因组测序。后续纳入94例来自上海（临近苏州）的TN-T2D患者的粪便样本进行宏基因组测序用于验证。来自NGT，Pre-DM和TN-T2D的84份粪便样本用于iTRAQ蛋白质组分析，每组28个样本。实验设计见图1。1.中国人糖尿病前期和2型糖尿病患者具有不同的宏基因组谱对254份粪便DNA样本进行宏基因组测序，并将原始数据过滤并与人肠道微生物组的整合基因目录（IGC）进行比对，以生成基因，分类学和功能谱。结果显示，与之前的研究一致，在NGT，Pre-DM和TN-T2D个体之间，基于微生物基因的丰富度，α-多样性和β-多样性没有显著差异（Kruskal-Wallis (KW）检验，p＞0.05)。使用宏基因组关联分析（Metagenome-wide association analysis，MWAS）鉴定出266,015个T2D相关基因（KW检验，p<0.05），并将这些基因聚类为126个宏基因组连锁群（Metagenomic linkage groups，简称MLGs，≥100个基因）。进一步应用KW检验来检测NGT，Pre-DM和TN-T2D个体之间MLGs在相对丰度上是否有统计学差异：与NGT个体相比，属于梭状芽胞杆菌（Clostridia）纲的MLGs的丰度，如Dialister invisus（MLG-3376）和Roseburia hominis（MLG-14865和MLG-14920），在Pre-DM或TN-T2D的个体中是显著较低的（图2A）；与NGT和TN-T2D个体相比，Pre-DM中产生丁酸盐的普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）（MLG-4560）的丰度较低（图2A）。相反地，与NGT相比，注释到大肠杆菌（Escherichia coli）（MLG-7919和MLG-7840）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）（MLG-6991）与伊格尔兹氏菌（Eggerthella sp.）（MLG-351）的MLGs在Pre-DM中具有很高的丰度（图2A）。其他比较请参见原文。这些重要的发现，进一步在上海TN-T2D队列中得到了验证。为了评估MLGs在T2D中的辨别能力，并鉴定不同疾病阶段区分个体的关键MLGs，采用特征选择方法并构建了随机森林（RF）分类模型。RF模型可以高性能地从两个不同的疾病阶段中将样本分类出来，ROC曲线下面积（AUC）值在0.90至0.94之间（图2B）。除了未分类的MLGs以外，用于区分TN-T2D和NGT的最具辨别力的MLG是粘液曲霉（Akkermansia muciniphila）。此外，注释到F. prausnitzii 和 E. coli的MLGs对从TN-T2D和NGT样本中分出Pre-DM样本很重要（图2C）。 通过KEGG富集分析以确定NGT，Pre-DM和TN-T2D个体中微生物功能潜力的可能差异模式，结果显示：与NGT个体相比，Pre-DM肠道菌群中多种模块富集，包括糖磷酸转移酶系统（PTS），氨基酸ABC转运蛋白和细菌分泌系统等（图2D）。TN-T2D中也具有类似富集；此外，与NGT和TN-T2D个体相比，Pre-DM个体在几种能量和核苷酸代谢模块方面表现出显著降低（图2D）。通过排除大肠杆菌基因，进行第二轮KEGG富集分析，发现多种Pre-DM富集的模块在Pre-DM和NGT个体之间无显著差异，这表明大肠杆菌可能是Pre-DM相比于NGT功能差异的重要贡献者。为了进一步了解与T2D相关的肠道菌群的功能变化，使用iTRAQ和LC-MS/MS方法进行蛋白质组学分析，鉴定出15,245个微生物蛋白质（97.29%）和425个人蛋白质（2.71％）。一种微生物肽通常表现出与具有高序列相似性的多种蛋白质的匹配，导致难以鉴定单个肽的微生物来源，因此使用最近研究报道的最大简约原则进行蛋白质去冗余，生成了11,980个非冗余蛋白。与其他组相比，分类学注释表明Pre-DM个体中独特的变形杆菌蛋白的比例更高，三组之间未发现与多种功能相关的唯一检测的微生物蛋白的分布差异。3.宏基因组和宏蛋白质组之间微生物群特征的一致性和不一致性门水平上>90％的基因和蛋白始终被分配到三个主要门，即厚壁菌门，拟杆菌门和变形杆菌门。尽管总体上具有一致性，但拟杆菌门具有更高的蛋白注释比例（41%），而基因注释比例为（25%）（图3A）。属水平上，宏蛋白质组偏向数量有限的属（81个），而宏基因组能鉴定到更多的属（212个）。通过Spearman秩相关分析，以确定宏蛋白数量与宏基因组属水平丰度之间关系。拟杆菌属、普氏菌属、普拉梭菌属包含大部分的宏蛋白（图3B）。通过比较宏基因组与宏蛋白组KEGG功能类别,发现碳水化合物代谢及翻译类别在两组学中不同占比。1508种蛋白（占微生物蛋白12.59%）能标记为10种KOs，主要为Ca激活的氯离子通道(K07114)、持家蛋白（K02355，K02358和K02395）等（图3C）。变形菌门宏蛋白质（主要来自大肠埃希氏菌，柠檬酸杆菌和肠杆菌）在Pre-DM显示增加的趋势，而拟杆菌属的宏蛋白倾向于在TN-T2D富集（图3D）, 与Pre-DM和TN-T2D相比，在NGT中参与碳水化合物糖代谢的宏蛋白水平较低（图3E）。图3宏基因组和宏蛋白质组中肠道微生物组特征的一致性和不一致
在425种检测到的人类蛋白质中，作者鉴定了NGT，Pre-DM和TN-T2D组中共有的218种人类蛋白质，占每组中鉴定出的人类蛋白质的59.6％至85.2％。通过GO注释以深入了解粪便中分泌的人类蛋白的功能特性，主要包括几种肠粘蛋白，例如MUC-1，MUC-2，MUC-4，MUC5B，MUC12和MUC-13以及annexins成员等。233种粪便人蛋白具有组织特异性注释，其中151种蛋白（64.81％）表现出在消化系统中高表达，其余蛋白则被注释为在血液或其他组织（如表皮）中高表达。仅在TN-T2D患者的粪便样本中检测到几种参与葡萄糖代谢的人类蛋白质，包括钠/葡萄糖共转运蛋白-1等，该蛋白的抑制剂用于抗糖尿病治疗。粪便中存在的人蛋白中有49种显示出至少两个组之间强度升高或降低的趋势，四种AMPs含量升高的趋势，包括防御素-5，中性粒细胞防御素-1，溶菌酶c以及分泌的磷脂酶A2，它们均在防御细菌方面起着重要作用（图4A）。据报道抑制变形菌门中多种生物生长的抗菌组织蛋白酶G的水平在Pre-DM样本中往往比NGT和TN-T2D高，并且这与较低的α-1抗胰凝乳蛋白酶和α-1抗胰蛋白酶水平相关，这两种都是组织蛋白酶G的抑制剂。网络分析揭示了NGT，Pre-DM和TN-T2D个体的两两比较中20种人类蛋白质之间的关联，这些蛋白质显示出与富集有关的不同趋势（图4B）。PRE-DM富集的大肠杆菌蛋白质和涉及天然免疫反应的人类蛋白质（HV304，HV305）和粘附（CEAM6，CEAM7）之间显著负相关（图4C）。图4 NGT，DM-Pre和TN-T2个体粪便样本中人类蛋白的表征在这项研究中，宏基因组学和宏蛋白质组学水平上都揭示了大量的Pre-DM相关特征。与TNT-2D相比，在Pre-DM和NGT中观察到了几个一致的特征：例如黏液Akkermansia muciniphila的丰度较高，而拟杆菌（Bacteroides spp）的丰度较低；与NGT相比，Pre-DM和TN-T2D中产生丁酸的几种厚壁菌（Firmicutes）物种的相对丰度较低，这些发现与糖尿病前期往T2D疾病的逐步发展相一致。在向T2D过渡之前，Pre-DM个体可能存在肠道生态系统的独特且非线性的变化。目前的研究当中，只发现了少量的相对高丰富度的粪便蛋白，尽管如此，宏蛋白质组学不仅为估算微生物蛋白的表达提供了一种有价值的补充，而且还可以描述宿主在不同疾病阶段的微生物蛋白相互作用。在这方面，确定了与TN-T2D和Pre-DM个人相比，NGT个体中几种宿主来源的AMPs含量更高的趋势，这表明与NGT个体抵抗（疾病相关）微生物相比，宿主防御能力可能更高。需要进行进一步的大规模纵向随访研究，以描述微生物功能如何从糖尿病前期转变为糖尿病，并揭示肠道微生物群与宿主之间在导致明显T2D转变的相互作用的本质。编者说与以往采用宏基因组与代谢组结合的方法研究疾病不同的是，本文通过宏基因组学与宏蛋白质组学技术全面表征了从糖耐量正常到糖尿病转变过程中肠道菌群谱和宏蛋白质组谱，揭示了向T2D过渡之前，Pre-DM个体可能存在的肠道生态系统的独特且非线性的变化。多组学联合分析是大势所趋，未来会有更多类似研究的文章出来。