怎样把土壤微生物与植物感病的互作关系做到10分 | 微生物专题

文章题目：马铃薯疮痂病的发生与土壤微生物群落组成和功能有关

研究单位：山东农业大学作物生物学国家重点实验室

发表杂志：Microbiome

发表时间：2019.02.01

影响因子：10.465

测序技术：16S rRNA基因测序（n=40，共计8组，每组5个生物学重复），宏基因组测序（n=10）

背景说明

土壤微生物与植物密切相互作用，是影响植物健康的重要因素。植物病原菌的出现和繁殖引起植物病害，而土壤微生物能预防植物病害，抑制病原菌，维持植物健康。利用微生物控制植物病害在许多方面都取得了成功，因此生物防治被认为是控制土传病害的理想途径。为了确保植物病害的生物防治在自然环境中更加稳定和有效，有必要清楚地了解病原菌、生物防治菌株和土壤微生物是如何相互作用的。病害的发生往往伴随着微生物群落的变化，如微生物丰度、组成和功能的改变，因此，对微生物群落进行额外的修复可能比简单地控制病原菌种群会更有效地治疗植物病害。研究表明，土壤微生物群落多样性与植物抗病能力密切相关，微生物多样性高，植物抗病能力强。微生物多样性高的土壤抗病性增强可能与土壤微生物相互作用网络的复杂性有关。复杂的微生物群落相互作用可以调节群落的稳定性，从而控制病原菌的繁殖。

马铃薯疮痂病是一种世界性的由生痂链霉菌（Streptomyces）引起的难治性病害，但其与土壤微生物的相互作用机制却鲜为人知。本研究分析了马铃薯疮痂病发病较重（H组）和发病较轻（L组）的薯表土（紧附薯块表层，geocaulosphere soil，GS）、根际土（紧附根表层，rhizosphere soil，RS）、根区土（植株生长区域，root-zone soil，ZS）和垄沟土（非植株生长区域，furrow soil，FS）中的微生物群落。目的是确定与马铃薯疮痂病相关的土壤微生物群落的组成并推定其功能。

主要结果与结论

检测了疮痂病植物毒素生物合成基因txtAB和细菌16S rRNA基因的拷贝数，以及4个土壤-根系分区的多样性和组成；GS是H组和L组间唯一表现出显著差异的分区。与H组相比，L组的txtAB基因拷贝数较低，细菌16S拷贝数较低，多样性较高，共生网络复杂性较高，GS菌群内的群落功能相似度较高。通过宏基因组测序进一步揭示了GS的群落组成和功能。变异菌属、寡养单胞菌属和农杆菌属是最丰富的属，与疮痂病严重程度、致病性链霉菌绝对丰度(EAA)、txtAB基因拷贝数呈显著正相关。与此相反，Geobacillus, Curtobacterium和unclassified Geodermatophilaceae与这三个参数呈显著负相关。与L组相比，H组ABC转运蛋白、细菌分泌系统、群体感应(quorum sensing, QS)、氮代谢、细胞色素P450部分代谢的相关基因得到了富集。相比之下，L组的一些抗生素生物合成途径得到了富集。基于群落组成和功能的差异，提出了一个简单的模型来解释土壤微生物群落与疮痂病发生的假定关系。GS菌群与土壤根系疮痂病严重程度密切相关，疮痂病的发生伴随着群落组成和功能的改变。这些不同的功能为阐明疮痂病发生与土壤微生物群落相互作用的机制提供了新的线索，而不同的群落组成为疮痂病的发生提供了新的见解。

之前已有报道，疮痂病是由几种不同的链霉菌物种独立引起的，包括S. scabies、S. acidiscabies、S. turgidiscabiies、S. europaeiscabiei、S. stelliscabiei 和S. bottropensis 。致病性链霉菌(Streptomyces)不仅能像寄生虫一样生活在马铃薯块茎的表皮，还能做为一种腐生菌生活在土壤中。这种病原体产生一种叫做thaxtomins的植物毒素家族，这种毒素是含有4-硝基色氨酸和苯丙氨酸残基的环状二肽(2,5-二酮哌嗪)，而thaxtomin A (ThxA)是家族中最著名的成员，已被证实与链霉菌的致病性有关。ThxA生物合成基因位于致病性链霉菌基因组的移动致病性岛(PAI)上。ThxA的生物合成途径包括txtA和txtB基因编码的两个非核糖体肽合成酶(NRPS)、一个P450单加氧酶(TxtC)、一个一氧化氮合成酶(TxtD)和一个新的细胞色素P450 (TxtE)。ThxA对植物细胞有抑制纤维素生物合成、促进植物细胞肥大和导致程序性细胞死亡的作用。

许多研究集中在通过生物控制剂治疗疮痂病，一些微生物，如某些菌株的杆菌和假单胞菌和一些非致病性链霉菌，已经被证明可以降低疮痂病的发病率和/或严重程度。在本研究中，研究者们调查了与不同疮痂病严重程度(H组和L组)。在每个植株周围采集GS、RS、ZS和FS的土壤，并进行分析。

研究者们通过qPCR和细菌16S rRNA基因扩增子测序，宏基因组测序（只检测GS）等手段，试图(i)确定土壤微生物群落特征与疮痂病密切相关的范围，(ii)阐明L组植物中土壤微生物群落的组成和功能概况，(iii)解释土壤微生物群落与疮痂病发生之间的相互作用。

材料与方法

本文研究的马铃薯品种Favorita 15对疮痂病敏感。取样的田间有多年的马铃薯种植历史，最后一次种植时发生了疮痂病。于2015年11月3日(种植后80天)采集样本，选取每株植物的GS、RS、ZS、FS四个土壤-根系分区，充分探讨土壤微生物群落与土壤-根系疮痂病严重程度之间的关系。该分析考虑了植物种群密度、外观、生长率和生长期；不包括大小异常的植物、害虫或机械损伤以及受边际效应影响的植物。用无菌不锈钢铲小心地收集块茎和根茎，轻轻地清除松散地附着在块茎和根茎上的土壤。疮痂病的严重程度根据病变表面覆盖的百分率用1 - 9分进行评估。根据疮痂病的严重程度，共选择10株植物。将1 ~ 5号植株进行分组，确定为H组(每个块茎的痂病严重程度为4级)，将6 ~ 10号植株进行分组，确定为L组(每个块茎的痂病严重程度为1 ~ 2级)。为了准确测量土壤微生物组与疮痂病严重程度之间的关系，特选择每株1个块茎，土壤与块茎和根表面紧密相连，分别收集GS和RS。简单地说，将块茎或根在无菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中大力搅拌，将所有的土壤从表面冲洗掉，然后用高速离心收集土壤。ZS采自植株根部生长区域，FS采自植株旁沟5 ~10 cm处。所有样本存储在低温冰袋( ~4℃)和运送到实验室在12 h。均质化后,每个样本的一部分存储在80℃。DNA提取之前,和剩余的样本立即处理进行理化分析。

结果

1)     结痂严重程度低组（L组）的GS具有低txtAB基因丰度、低细菌丰度和高多样性的土壤-根系分区微生物群。

图1

TxtAB是疮痂病毒素ThxA生物合成的关键基因，能够准确定量病原链霉菌株。为了确定结痂病原菌的丰度，所有的土壤样品都被用来检测thaxtomin生物合成基因txtAB的拷贝数，但是只有GS在实时PCR系统中产生了清晰的荧光信号，表明GS含有大量的结痂病原菌，而其他样品含有很少或没有结痂病原菌。此外，GSH和GSL的txtAB基因拷贝数存在显著差异，且与病情严重程度呈显著正相关（Spearman，ρ=0.97，P=5.55×10-6）。txtAB以及OTU数目在不同组间存在一定的差异。

为了观察土壤样品中细菌群落的相似性和差异性，采用Bray-Curtis聚类方式对16S rRNA基因扩增子测序的细菌OTUs进行PCoA分析。这一发现表明，GSH和GSL细菌群落组成存在显著差异。ZS和FS高度重叠，说明这两个土室的细菌群落基本相似，但仍有一些不同的特征。

2)     严重程度不同的疮痂病在GS中的菌群组成存在显著差异

表1

采用双尾Wilcoxon秩和检验来评估不同组间在属级细菌相对丰度的差异。与PCoA结果一致，不同土壤分区间分化属数最多（P<0.05）。RSL与FSL共发现143个分化细菌属，GSH与FSH共发现132个。值得注意的是，GSL和RSL之间有53个分化的细菌属，而GSH和RSH之间只有7个分化的细菌属，表明H可以减少GS和RS之间的群落差异，在4个土壤根系分区中，GS有58个分化的细菌属（P<0.05），远大于RS、ZS和FS中的1、5和7个细菌属。这进一步证明GS的细菌群落组成与疮痂病的严重程度有关。

3）结痂严重程度较低组（L组）的GS具有低丰度的致病性链霉菌

表2

本研究进一步证实了酸性链霉菌和膨胀链霉菌的存在，并确定酸性链霉菌是本研究的主要病原菌。酸性链霉菌和膨胀链霉菌的相对丰度之和被定义为致病性链霉菌的相对丰度；其他链霉菌种类为非致病性链霉菌。病原链霉菌的丰度可以反映结痂的严重程度，病原链霉菌的EAA比相对丰度更适合反映txtAB基因拷贝数和结痂的严重程度模式。

4）GS微生物群的群落组成和功能与疮痂病相关

为了阐明GS中疮痂病敏感属，选择了3个参数，包括结痂严重程度、致病性链霉菌EAA和txtAB基因拷贝数，并用Spearman与细菌属EAA的相关分析进行了分析。这三个参数之间呈显著正相关。28个属（Spearman，|ρ|>0.6，P<0.05）与结痂严重程度显著相关，其中与17个属正相关，与11属负相关。16个属（Spearman，|ρ|>0.6，P<0.05）与病原链霉菌EAA显著相关，其中与13个属正相关，与3个属负相关。27个属与txtAB基因拷贝数显著相关（Spearman，|ρ|>0.6，P<0.05），其中与16个属正相关，11个属负相关。与多个参数相关的微生物被认为是最受关注的，共有13个属与3个指标均显著正相关（Spearman，|ρ|>0.6，P<0.05）。值得注意的是，在所有相关属中，Variovorax表现出最高的EAA；四个属（慢养单胞菌属、农杆菌属、鞘氨醇菌属和链霉菌属）表现出很强的相关性（Spearman，p>0.8，P<0.05）。显著的相关性和较高的EAA比值（GSH vs.GSL）增加了这些属与疮痂病相关的可能性。此外，三个属（土杆菌属、柯特杆菌属和未分类的地杆菌科）显著负相关（Spearman，-1≤ρ<-0.6，P<0.0 5）与3个指标、7个属与病原链霉菌的结痂严重程度和结痂拷贝数呈显著负相关（Spearman，-1≤ρ<-0 6，p<0 0 0 5），而与病原链霉菌的EAA无显著负相关。

图2

EAA细菌属与痂病严重程度、致病性链霉菌EAA与txtAB基因拷贝数之间的相互作用网络。红线代表正相关，蓝线代表负相关。每个节点的大小与每个属的EAA成正比。每个节点的颜色表示每个属的EAA的比值。

图3

基于Bray-Curtis差异的宏基因组细菌群落组成EAA和KO功能类相对丰度的差异分析。在热图中，品红色表示不相似系数较小(接近0，相似度最大)，青色表示不相似系数较大(接近1，相似度最小)。箱线图揭示了在热图中组内和组间的不相似的系数分布。

图4

使用双尾Wilcoxon试验量化和可视化GSH和GSL之间的功能差异，在GSH和GSL中分别发现240个和561个显著富集的KO功能类别（图a）。为了阐明在这些差异中，哪些KO功能类别是最主要的，图b中描述了相对丰度大于0.03%的差分KO功能类别。通过这个过滤阈值，保留了98个差异KO功能类别，其中16个显著富集于GSH，82个显著富集于GSL。值得注意的是，K02035的相对丰度（平均值为0.19%）在所有不同的KO功能分类中最高，K00799的相对丰度为次高；它们都富含谷胱甘肽。K02035是一种肽/镍转运系统的亚速率结合蛋白，属于QS途径，K00799（土壤-根系分区，谷胱甘肽S-转移酶，平均0.14%）参与了谷胱甘肽代谢和外源生物降解代谢途径。为了进一步探索所有不同的KO功能类别参与的途径，分别对GSH或GSL中富集的KO功能类别进行了KEGG途径富集分析（图c）。

假设模型

基于微生物组成和功能概况，作者提出了土壤微生物群落对疮痂病影响的假设模型。除了致病性链霉菌对疮痂病发生的直接作用外，一些土壤微生物还可以直接或间接地促进或抑制疮痂病的发生。一些微生物通过ABC转运蛋白、细菌分泌系统、QS途径与致病性链霉菌形成相互作用的联合体，促进其thaxtomin生物合成基因的表达，帮助致病性链霉菌感染宿主。纤维素水解菌株，如变异体和寡养单胞菌，可以通过产生纤维二糖和纤维三糖来刺激致病性链霉菌合成ThxA，而一些不确定微生物的氮代谢和细胞色素P450可能有助于ThxA的生物合成。而抗生素的生物合成可以控制微生物群落的生物量和/或减少致病性链霉菌的数量，从而间接和/或直接延缓疮痂病的发生。也有一些类群，如杆菌和假单胞菌，可以抑制ThxA的生物合成和/或减少致病性链霉菌的数量，而非致病性链霉菌也可以由于生态位重叠而减少致病性链霉菌的数量。该模型为阐明马铃薯疮痂病的发生提供了一些基本的认识和思路。然而，这个假设的模型仍然是不完整的，需要发现与疮痂病相关的其他微生物和功能。此外，今后还需要开展更多的鉴别微生物和功能的研究。

图5

土壤微生物对疮痂病影响的假设模型。圆形矩形表示微生物菌种，圆形表示物质。红线表示晋升；绿线表示抑制；灰色线条表示物质的产生。

讨论

土壤微生物在植物病害的发生和防治中起着重要的作用，在以往的研究中已经发现微生物群落能够成功地抑制植物病害。尽管一些菌株在先前的研究中已经被证明可以降低疮痂病的发生率和/或严重程度，但是还没有系统地研究土壤微生物组和疮痂病之间的相互作用，因此本文作者使用qPCR、细菌16S rRNA基因测序以及宏基因组测序系统地考察了土壤微生物组和疮痂病之间的关系。确定哪些土壤根系分区与疮痂病密切相关是一个极为重要的问题，因为这与周围土壤是否适合继续种植马铃薯有关。因此，研究了马铃薯植株周围4个土壤根系分区GS、RS、ZS和FS中疮痂病与细菌群落组成的关系。（i） 高txtAB基因拷贝数只在GS中检测到，而在其他的分区中很少或没有检测到（图1a）。（ii）细菌16S rRNA基因拷贝数在H和L之间存在显著差异，而在RS、ZS和FS中则没有差异（图1b）。（iii）扩增子测序和α多样性分析表明，GS中H组和L组之间仅存在边际显著差异，其他土壤分区中未发现显著差异（图1c）。（iv）PCoA显示GSH和GSL可以根据结痂程度区分，但RS、ZS和FS没有明显的分离（图1d-h）。（v） Wilcoxon检验显示，H和L在GS中有58个显著分化的属，远远超过RS中的1个分化属、ZS土壤中的5个分化属和FS中的7个分化属（表1）。此外，马铃薯抗性基因型和易感基因型的致病性链霉菌种群水平在块茎中存在显著差异，但在根或根际土壤中没有发现差异。同样，在马铃薯植株中轴10厘米范围内的土壤微生物群落组成也没有发现显著差异，这相当于本研究中的ZS。综上所述，这些结果表明所研究的GS菌群与疮痂病的发生密切相关，而RS、ZS和FS菌群与疮痂病的发生无关。微生物是土壤健康的一个指标。在该研究中，GSL中发现的细菌α多样性指数（OTU数、Chao1和Shannon）略高于GSH，txtAB基因丰度显著低于GSH，细菌丰度较低，细菌群落共现网络复杂度较高，在GSL中也观察到较高的微生物功能相似性。许多先前的研究报告表明，土壤细菌群落多样性越高，通常与对病原体入侵的抵抗力越强有关，GSL中的细菌群落多样性越高，表明它可能对疮痂病的抵抗力越强。

本研究旨在探讨土壤微生物与疮痂病之间的相互作用，证实GS的微生物群落组成和功能与疮痂病的严重程度有关。低txtAB基因丰度、低细菌丰度、高多样性、高共生网络复杂度、高群体功能相似性是马铃薯疮痂病发病低的指标。与结痂严重程度高的马铃薯相关的GS微生物组含有致病性相关基因，H组与ABC转运体、细菌分泌系统、QS、氮代谢途径和细胞色素P450代谢有关的基因显著丰富。与之相反，L组中一些抗生素的生物合成途径明显丰富。该研究拓宽了对疮痂病的发生与土壤微生物之间关系的理解，并为疮痂病的发生提供了新的见解。

参考文献

Shi Wencong, Li Mingcong, Wei Guangshan, et al. The occurrence of potato common scab correlates with the community composition and function of the geocaulosphere soil microbiome.[J] .Microbiome, 2019, 7: 14.

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