其他
代谢组学样本前处理和发展趋势 | 代谢组学专题
上一节我们了解了代谢组学的研究方法（科普帖！代谢组学研究方法），也学习了不同物种样品的采集和制备。样品的前处理策略选择有助于给定实验的成功，因为其会影响观察到的代谢物图谱和数据的质量。在给定的研究中，样本制备方法的能力和局限会影响生物学解释的准确性。例如Xavier发表的关于不同萃取方法提取微生物代谢物，所得到的结果显示27个代谢通路中有17个通路显示出相反的上下调关系，表明随提取方法的不同数据会产生了相互矛盾，体现了代谢组学中样本制备方法的选择，对观察到的代谢物和准确的生物学解释，有较大的影响。本节罗列了5种样本前处理的技术以及发展趋势。图1所示合适的提取方法提取细胞样本的代谢物。
图1
从生物标志物发现的角度来看，最矛盾的需求之一是代谢终止，包括细胞，植物和组织的样本。代谢终止的目的是使用低温，加酸或者快速加热来阻止代谢过程，然而代谢过程是非常快的，往往具有小于1s的时间尺度，例如ATP，6-磷酸-葡萄糖和腺苷等。因此在适当的时间尺度内，可能非常难以实施适当的终止步骤，增加一个终止步骤可能导致无意降解或者某些代谢物的损失。例如，Deprez S发表的在冷藏的大鼠血浆中，残留的酶导致胆碱、甘油、酪氨酸和苯丙氨酸水平上升。对于稳定的代谢物，代谢终止的意义不大；但是对于易于降解或者转化的不稳定代谢物，代谢终止的步骤很重要，虽然不稳定的代谢物所占的比例较低，但是也可能这些比例较低的代谢物正是重要的生物标志物，例如上面提到的腺苷以及谷胱甘肽等都被报道为癌症的生物标志物。因此，确定哪些代谢物并不会受到不同终止/存储条件的影响，对于代谢组学领域的成熟和生物标志物的发现，会有重要作用。
2生物体液样本的前处理方法2.1 直接稀释进样一般适用于尿液样本，典型的稀释比采用纯水稀释1:10倍。图3概括了尿液以及血浆等生物体液所推荐的LC-MS分析流程。
从图中可以看出，丙酮/甲醇混合物和甲醇沉淀可以获得最佳的代谢物覆盖。2.3 超滤超滤是一种常见的生物样品制备放方法，其根据分析物的分子质量来分离。例如3000Da的滤膜可以从蛋白质或者其他大分子中分离小分子质量的代谢物。然后，超滤对极性分子有一定的偏向性，和溶剂沉淀相比，会显著损失疏水性代谢物的种类。2.4固相萃取（SPE）SPE广泛应用于靶向的生物分析，步骤如下：1.分析物吸附在溶剂表面；2.通过淋洗去除比分析物吸附能力弱的干扰物；3.使用溶剂将分析物洗脱下来。例如我们所熟知的C18柱，现在C18和聚苯乙烯-二乙烯基苯吸附剂组合已经被用于非靶向相代谢组学研究。SPE 现在的困难点在设计通用的提取条件。
3生物样本前处理发展趋势3.1 体内取样：固相微萃取（SPME）活体取样避免了采样过程中，样品可能会暴露于氧、溶剂、pH条件下造成的代谢图谱变化，以及相应的各种生物过程被激活。SPEM技术能很好的平衡亲水和疏水代谢物的提取，这项技术可以应用于小鼠循环血液代谢物的活体取样。如图5（A）所示，吸附剂颗粒直接固定在金属线的外面，这个金属线可以容易的容纳在皮下注射针的内部。因为SPME所用的吸附剂对样本的比例很低，所以目标分析物数量不会很多。图5（B）是溶剂沉淀的流程图，举个例子，SPME（1868个代谢物）、溶剂沉淀血浆（3969个特征物质）和超滤（2262个特征物质）表明，SPME有很好的代谢覆盖率。这个方法的可以避免不良反应以及蛋白的吸附或者凝血现象的发生。
3.2 湍流色谱法（TFC）TFC法允许直接将未经处理的血清注入到LC-MS中，因为TFC满足大颗粒（25-50um）和小粒径（0.5-1.0um）的条件，大分子物质不能保留，小分子可以被检测出来。TFC的潜在优势是高度量，高自动化和最小的样本处理，可以减少样本处理流程中外来污染物的引入和无意的样品流失。
4总结图6总结了全代谢组学中所使用的各种提取方法，一般来说，在LC-MS的代谢组研究的平均标准偏差（RSD）在15%~20%，是个合理的目标，所以我们在做代谢组学时，需要理解所选择的方法的优缺点，以及考虑所得到数据的生物学解释。