图说 | 转录后基因沉默（RNA干扰）

❖背景

        转录后基因沉默即RNA干扰（RNA interference，RNAi），使用RNA干扰（RNAi）治疗的关键优势在于能够有效地特异性下调基因表达。由于RNAi在基因沉默方面的高效性和简单性，RNAi是基因功能研究的重要工具。本期内容将简要介绍转录后基因沉默的发生机制。

---

❖A. siRNA介导的转录后基因沉默

➢细胞中的双链RNA（dsRNA）的来源途径

1. 病毒复制过程中形成的dsRNA

2. 清道夫受体（Scavenger receptor）导入的外源dsRNA（通常为体外人工合成）

3. 直接转录得到的dsRNA

   1）转座子或转基因中的反向重复序列转录得到的RNA反向互补形成dsRNA

   2）顺式反义基因即从靶基因的反链DNA上转录得到的RNA与其互补的RNA形成正义—反义dsRNA

   3）转基因转录得到的”异常“RNA在RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP或RDR）的作用下形成dsRNA

➢作用机制

1. Dicer酶是属于RNase III家族的一种核糖核酸内切酶，可以特异识别dsRNA。Dicer酶与dsRNA结合蛋白（dsRBD）结合，将dsRNA剪切成长度为21–24 nt的siRNA。

2. siRNA在细胞质内与Argonaute蛋白（Ago）等若干个蛋白质组合形成的RNA诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC)结合。

3. siRNA中与靶标RNA完全互补配对的一条siRNA链为guide链(guide strand)，另一条siRNA链为passenger链 (passenger strand)。RISC复合物上的siRNA解开成单链，passenger链将被裂解，guide链被保留。

4. siRNA guide链通过碱基互补配对识别目的mRNA，RISC利用Ago的核酸内切酶活性切割目的mRNA。

5. 在哺乳动物和果蝇（Drosophila）中，剪切产生的目的mRNA片段被降解。

6. 植物、秀丽隐杆线虫（C. elegans）和真菌的基因组编码RdRP。在植物、秀丽隐杆线虫（C. elegans）和真菌中，mRNA片段作为RdRP的模板，产生更多的dsRNA，Dicer酶再将其剪切成次级siRNA。这些次级siRNA与SAGO（合成的次级siRNA缺陷型Ago）结合，介导识别目的mRNA，进一步下调了目的mRNA的表达。

---

❖B. miRNA介导的转录后基因沉默

➢B1. 动物miRNA的生物合成

1. RNA聚合酶II将miRNA基因转录为初级miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA折叠形成茎环结构。

2. 在细胞核中，RNase III酶Drosha与dsRBD蛋白结合，将动物pri-miRNA切割成长度为50-80 nt的前体miRNA（pre-miRNA）。

3. Pre-miRNA被Exportin5-Ran-GTP复合物转运到细胞质，然后被结合了dsRBD蛋白的Dicer酶进行第二次剪切，得到大约21 nt的包含成熟miRNA链和passenger miRNA*链的双链miRNA。

4. 双链miRNA与含有Ago蛋白的microRNA核糖核蛋白复合体（miRNP）结合，双链中的passenger miRNA*链被裂解，miRNP中保留成熟的miRNA链。

mirtron途径

在秀丽隐杆线虫和果蝇中发现了产生miRNA的第二种途径，短小的内含子被剪接和去分支形成具有茎环结构的pre-miRNA，这些miRNAs被称为mirtrons。mirtron途径绕过Drosha酶的剪切过程。

➢B2. 植物miRNA的生物合成

1. 植物miRNA基因被RNA聚合酶II转录。

1. 与动物miRNA合成过程相反，生成miRNA-miRNA*双链的两个剪切步骤是都是由与dsRBD蛋白HYL1结合的Dicer酶类似蛋白DCL1酶在细胞核中发生的。

1. 接下来，HEN1介导双链的3'端甲基化，双链被植物Exportin5同源物Hasty转运至核外。

2. 双链miRNA与含Ago1蛋白的miRNP复合物结合并保留成熟的miRNA链，在大多数情况下指导mRNA剪切，少数情况下抑制翻译。

➢B3. miRNA介导的转录后基因调控

miRNA介导转录后基因调控的机制仍然有许多细节尚不明确。

・miRNA和目的mRNA的3'UTR之间发生部分碱基配对，可以导致在翻译起始步骤或起始后步骤发生mRNA翻译抑制，或者导致miRNA介导去腺苷酸化后发生mRNA降解。

・miRNA和mRNA之间的完美碱基配对可导致发生核酸内切裂解和裂解产物降解。

已经提出但尚未通过实验证明的另一种机制是新生多肽链的蛋白水解。

❖C. 植物中的反式-siRNA

1. 在植物中，一些特定的miRNA指导剪切来自反式作用小干扰RNA（ta-siRNA）基因（TAS基因）的转录产物。

2. SGS3保护剪切的产物免于降解，剪切产物在RNA依赖的RNA聚合酶6（RdR6）作用下将5'或3'片段合成为dsRNA。

3. Dicer酶类似蛋白DCL4（可能还有DCL1）将dsRNA剪切成21 nt的siRNA，这些siRNA作为ta-siRNA，整合到RNA诱导沉默复合体中，指导目的mRNA的切割，调控目的基因的表达。

相关阅读