图说 | 高通量测序应用

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高通量的下一代测序（NGS）技术实现了通过相对较低的成本进行大规模并行测序，彻底改变了基因组学，表观基因组学和转录组学研究。本快照发表于2011年，重点介绍了NGS日益多样化的应用，包括基因组测序/重测序，转录组测序，小RNA测序，DNA / RNA-蛋白质相互作用分析和核糖体谱分析。此外，还提供了有关可用NGS平台的快速指南（表1），以及它们的基本方法和独特功能。

基因组测序/重测序

全基因组测序分为从头测序(de novo sequencing)和重测序(re-sequencing)。从头测序不需要任何参考基因组信息即可对某个物种的基因组进行测序，利用生物信息学分析方法进行拼接、组装，获得该物种的基因组序列图谱，从而推进该物种的后续研究。基因组重测序是对有参考基因组物种的不同个体进行的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。全基因组测序/重测序和靶向基因组重测序已广泛用于序列多态性发现和突变匹配。这些应用正在迅速促进我们对人类健康和疾病的理解，也促进了未表征基因组的从头组装。

DNA-蛋白质相互作用和表观基因组测序

染色质免疫沉淀与高通量测序结合形成一项强大的技术ChIP-Seq，可对DNA-蛋白质相互作用和表观遗传标记进行全基因组分析。它促进了广泛的生物学研究，包括转录因子结合，RNA聚合酶作用位点，核小体定位和组蛋白修饰。用于研究染色质结构和组成的补充方法还有用于分析DNA甲基化的Methyl-Seq和分析脱氧核糖核酸酶超敏感位点的DNase-Seq。

转录组测序/ RNA-Seq

转录组测序/ RNA-Seq的引入为表征和定量转录本提供了一种新方法。通常，将总RNA，去除核糖体RNA的总RNA或poly（A）RNA逆转录为双链cDNA片段，然后对其进行高通量测序。此策略已应用于分析mRNA和非编码RNA表达，可变剪接，反式剪接和可变聚腺苷酸化（多聚腺苷酸与mRNA的共价连结），以及匹配转录起始，终止和RNA编辑位点。相关应用包括靶向RNA-Seq，直接RNA-Seq，链特异性RNA-Seq和新生RNA-Seq（例如，全局连续测序（GRO-Seq）和天然延伸转录本测序（NET-Seq））。

RNA-蛋白质相互作用

CLIP-Seq，也称为HITS-CLIP，利用紫外照射下RNA在体内与RNA结合蛋白发生耦联，然后进行免疫沉淀和高通量RNA测序以揭示转录组范围的RNA-蛋白质相互作用。改进的CLIP-Seq技术，例如PAR-CLIP（可光激活的核糖核苷增强CLIP）和iCLIP（单个核苷酸分辨率CLIP），已用于提高交联效率和分辨率。

小RNA测序

与RNA-Seq相似，对小RNA进行测序，可深入了解不同生物体，组织和细胞类型，发育阶段和疾病状态中的小RNA种群。它极大地促进了我们对不同类别的小RNA（例如microRNA（miRNA）和与Piwi相互作用的RNA（piwiRNA））的功能和调控机制的理解。随着Argonaute（Ago，小RNA介导的基因沉默途径的核心效应分子）HITS-CLIP的最新发展，可以同时检测Ago结合的microRNA和mRNA片段，从而可以大规模绘制体内miRNA-mRNA相互作用。

核糖体图谱

核糖体图谱采用经典的核糖体印记分子技术，借助核酸酶破坏掉没有被核糖体保护的翻译后mRNA中的区域，确定正在翻译的核糖体的精确位置，进而确定新蛋白的合成和对编码区域进行注释。除了NGS对转录组学研究的深远影响外，对核糖体保护的mRNA片段进行高通量测序的方法的开发，为全基因组范围内参与翻译的mRNA的分析提供了强大的工具。

其他应用及未来方向

高通量测序是一项快速发展的技术，在未来几年中，可能会继续改变“组学”研究的面貌。尽管NGS技术为当前广泛的研究应用提供了动力，但不断开发出新的创新技术。这些措施包括barcode测序策略，用于多重分析样品，宏基因组分析，蛋白质-蛋白质相互作用组作图（“ Stitch-Seq”）和DNA亲和力景观的高清测量（HiTS-FLIP）。未来的技术进步和应用有望进一步改变我们对进化生物学和基因型-表型关系的理解，并最终将个性化药物引入临床。

后记：可以看到，9年过去了，高通量测序如作者所说，迅速发展，从第二代测序，到第三代测序，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，到现在的单细胞测序，在单个细胞水平上提示基因结构和表达状态，反映细胞间的异质性，单细胞测序正成为生命科学研究的焦点。

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