图1
上一节我们学习了代谢组学的样本前处理（代谢组学样本前处理和发展趋势 | 代谢组学专题），不同的样本前处理方法可能会得到不一样的数据。代谢组学的研究需要高灵敏度、高通量且稳定性好的方法，所以检测平台的选择也是至关重要，比如我想检测菌体样本的胆汁酸，那优先推荐气相质谱联用；当我想检测血清样本的有机酸时，推荐液相质谱联用；当我想不破坏样本结果，那优先推荐NMR。图1 罗列了代谢组学常用的几种检测技术，下面小编将着重点介绍一下三种技术：核磁共振技术（NMR）、气相色谱质谱联用技术（GC-MS）和液相色谱质谱联用技术（LC-MS）。
核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学技术。其基本结构图如图2所示。根据NMR原理（感兴趣的读者可以自行知乎或者百度），射频频率有60MHz、100 MHz和600 MHz等；磁体类型有永磁、电磁和超导磁体等；仪器工作时可分为连续波和脉冲傅里叶变换核磁共振波谱仪，因为傅里叶变换检测的灵敏度更高，检测时间更短，所以已经替代了连续波波谱仪。NMR常被我们诟病的是它的灵敏度，低浓度的代谢物检测出来的概率较低。图2展示的是NMR和色谱质谱联用的灵敏度比较，从图3中可以看出，NMR最小检测浓度是uM级别，远低于色谱质谱联用的nM级别。NMR的优点非常适合无损采样，最小的样品制备以及同时检测具有不同的物理化学性质的代谢物。通常用于研究生物样本的核磁共振的活性核包括1H、13C、15N和31P。由于一维（1D）1H-NMR谱（氢谱）的高天然丰度（99.98%）和高的灵敏度（高磁旋比），其在代谢组学研究中应用较多。图4展示的是尿液和血浆样本氢谱图（500MHz），图中的每一个数字表示鉴定的一个代谢物。气相色谱（GC）是以气体为流动相的色谱分析方法，适合于分离分析易气化、稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合同系物，同分异构体的分离。质谱法（MS）即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子等）按它们的质荷比分离后进行检测的方法，其基本原理是样本进入质谱仪器，在质谱仪离子源中，化合物被电子轰击，电离成分子离子和碎片离子，这些离子在质量分析器中，按质荷比大小顺序分开，经过电子倍增器检测，即可得到化合物的质谱图。图5展示了气相的仪器组成。色谱的特点是将复杂混合物分离成单一组分，但是定性结构能力较差；质谱等技术对一个纯组分结构确定更为容易，GC和MS的协同耦合使得串联技术成为代谢组学分析的一大主力，GC/MS是一个很好的工具可应用于大量代谢组学的分离、检测和定量，图6列出来了其优点和局限性。GC-MS最让我们诟病的是需要对样本进行衍生化处理，这增加了样本制备的时间。GC-MS的优点是灵敏度高，在色谱的重复性、分辨率和电子轰击电离源得到的质谱碎片的重复性有明显优势，且受基体效应的影响较小。图7罗列了尿液样本的GC/TOFMS图。高效液相色谱（HPLC）是以液体为流动相的色谱法，其基本原理是色谱过程中不同组分在相对运动，不相混溶的两相间进行交换，相对静止的一相为固定相，相对运动的相为固定相，利用吸附，分配，离子交换，亲和力或分子大小等性质的微小差别，经过连续多次在两相间进的质量交换，使不同组分得到分离。图8展示了LC-MS流程示意图。液相质谱联用技术面临的问题是液相流动对质谱工作条件的影响，同时质谱离子源的温度对液相色谱分析源的影响。还有一个比较重要的一点，不同参数，不同仪器的液相质谱得出的数据都不完全相同，现阶段使用的数据库，更多的是自己建库或者解析图谱。液相质谱常用的分类类型是常规梯度反相色谱（RPLC），RPLC的局限之一是分析极性/离子型代谢物，因为这些物质的保留性差，很容易洗脱，因此，RPLC适合中等极性或者非极性代谢物的分离。分析这些不保留的代谢物需要不同的策略，例如亲水性相互作用（HILIC）、离子对（IPLC）和离子交换（IEC）等，图9列出LC-MS能够检测的代谢物类型。近期离子迁移谱（ion mobility spectrometry，IMS）结合LC-MS相关的代谢组学文章也多有发表，IMS的核心原理是电场驱动下离子在气体阻尼环境中的迁移速率差异。IMS的这种机制以及提供分离作用，还可以确定分子的“碰撞截面”（CCS）。增加离子迁移能力的质谱仪，通过提供正交的分离尺寸，在MS检测之前分离具有不同CCS值的共洗脱代谢物，提高了光谱质量并帮助代谢物表征/鉴定。图10罗列出IMS和DIA分析数据鉴定代谢物的比较。从图中可以看出结合了IMS的质谱，显示的色氨酸光谱更清晰。本节罗列了基于代谢组学的三大检测技术，目前没有一个平台能够完全的对全谱代谢物进行鉴定，所以各位朋友在选择代谢组学之前，也要考虑选择哪种技术来测数据。下一节，小编将带来基于质谱分析法的代谢组学数据处理。Proteomic and Metabolomic Approaches to Biomarker DiscoveryVan, Q. N. (2008). Comparison of 1D and 2D NMR spectroscopy for metabolic profiling. J Proteome Res, 7(2), 630-639.Rainville, P. D. (2017). Ion mobility spectrometry combined with ultra performance liquid chromatography/mass spectrometry for metabolic phenotyping of urine: Effects of column length, gradient duration and ion mobility spectrometry on metabolite detection. Anal Chim Acta, 982, 1-8.Pasikanti, K. K.(2010). Noninvasive urinary metabonomic diagnosis of human bladder cancer. J Proteome Res, 9(6), 2988-2995.许国旺. 代谢组学: 方法和应用[M]. 科学出版社, 2008.