样本准备基本原则和常见样本起始量
a)本指南中的方法和建议绝大部分适用于以DNA为检测对象的16S/ITS 扩增子测序和宏 基因组测序等。
b)由于样本采集方法不是唯一的，本指南提供为一般性方法 。如您使用的方法已被证明有效或是您希望参照所研究领域的文献方法， 您可以使那些方法进行 样 。辅助材料也有少部分微生物样本RNA处理指南方法。
c)特别注意 ，样本寄送过多或过少都不利于实验正常开展，请参照指南要求的量提供。如有疑问可询问我方人员 。
d)如样本需同时进行其他检测（如代谢组检测 ），请参照相项目要求采集和保存样 本。不同检测项目的样本需分开保存于独立的样保本管中
e)采样过程应尽量避免对样本的干扰，缩短保存和运输时间，使样本尽可能代表自然状态下的微生物原貌。
f)样本采集后，请尽快将样本置于-80 ℃保存或液氮速冻保存，或马上进行样本 DNA 抽提，避免样本储存不当影响实验结果
g) 联川不接收含病原微生物的人源样本（如传染病人的肠道来源样本），或是含有可传人病原微生物的哺乳动物来源的样 本，或是无法判断是否有危害的样本。但可以接收病原微生物或上述样本提取的DNA样本，或是已做灭活处理的致病菌样本。致病菌灭活操作请见附件
h)整个样本采集过程，都须遵守无菌操作。
常见组织样本微生物组学最低起始量（仅供参考）
DNA 样本送样指南：
基因组 DNA
总基因组 DNA 溶于 10mM pH 8.0 Tris 盐酸或其他 DNA 提取试剂盒提供的，扩增子测序浓度≥10ng/μL，总量>50ng。宏基因组测序浓度>50ng/μL，总量>1μg。细菌完成图或细菌重测序浓度>50ng/μL，总量>10-30μg。电泳时 gDNA 样品电泳 条带清晰，主带长度应大于 10kb，无明显降解，.260/280≈1.8-2.0。基因组 DNA 沉淀保存于 75%乙醇中，置于-80℃冰箱长 期保存，干冰运输。细菌
由于每种细菌的 DNA 产量可能不同，用户可以根据细菌基因组提取的经验，判断需要收集多少样本能够满足 DNA 提取的总量要求。通常在显微镜下观察细菌生长状态，收集对数期的细菌。然后将适量体积的菌液转移至 2mL 耐-192℃超低温无核酸酶的离心管或冻存管中，4℃ 14000g 离心 1min。获取实验所需量的细菌沉淀。最后弃尽培养基，将细菌沉淀迅速置于 液氮中冷冻>3h，转移至-80℃保存或干冰运输。a.我们不接受菌液样本，也不接收带有固体培养基的细菌样本。b.为确保实验的顺利，建议在取样时同时备份 2~3 份样品，以防实验样本降解、重新取材或其它原因导致的实验周期延长。在送样样品的实验完成后，备份的样品可以进行其他方面的实验，包括定量 PCR 验证，蛋白组学实验等。样品备份可以分为 两种，一种为严格备份，即样品取下后一分为二，这样的两份样品基本上具备相同性质。另一种为非严格备份，即生物学重 复样品，这样的备份样品同质性要较前者差。用户可以根据实际情况选择适合的样品备份方式。在采样前，请根据既往的课题经验或是文献中的标准，确定受试对象的纳入与排除的具体标准，以及采集条件（如采样 部位、样本类型、采集时间等）；采样前，在采样管（如 2mL 螺口冻存管）及自封袋上用油性笔注明取样对象信息（如姓名、样本编号、样本类型、取样 时间等）；同一研究所有样本的采样方法、采样部位、采样时间需保持一致，且样本一式多份保存，避免反复冻融。2.1 成年人粪便
①在收集粪便样本前将尿液排尽，避免尿液污染粪便。将无菌粪便收集盒（或其他无菌收集器）放入蹲式（或坐式）马桶后排便，确保粪便排入盒中。②将手洗干净或戴上无菌手套，拧开 2 mL 无菌冻存管盖，将灭菌棉签的棉头插入粪便中，并轻微搅动。③注意！因粪便表层含有肠粘膜脱落细胞，而外部容易污染，且接触空气后，部分细菌 DNA 开始降解，所以取样时应取 中段内部的粪便样本。④用棉签取黄豆大小（约 50 mg）样本放入螺口冻存管，取出棉签，旋紧冻存管盖。一式三管。如用于宏基因组测序， 以及其他项目检测，建议取样 5~10 管。⑤将冻存管放入自封袋中，并封紧，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4h）送至实验室进 行 DNA 抽提或-80℃保存。防止反复冻融。粪便样本常温采集法：
在收集粪便样本前将尿液排尽，避免尿液污染粪便。带一次性无菌手套，将新鲜粪便收集到无菌粪盒里，或采用润滑的 无菌医用拭子对会阴部刺激促进排便。然后用无菌棉签挑取粪便至无菌螺口冻存管，一式三份，每份 100mg。将冻存管放入 自封袋中，并封紧，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃ 保存。防止反复冻融。2.3人体肠道组织样本（内部菌）
①用灭菌剪刀、解剖刀切取相关部位指甲盖（1cm2）大小左右组织块。组织表面如有污浊物或是血，请用预冷的无菌 PBS 快速清洗 2 次，吸干。②将组织块放入无菌螺口冻存管中并旋紧盖子，置入液氮速冻 1 小时后，转入-80℃冰箱保存。2.4肠道灌洗液
①将肠道灌洗液低速离心（200-500 g 离心 5 min）收集上清液，将上清液过 0.22 μm 可拆卸的滤膜，收集滤膜；放入-80℃冰箱保存。②或者将肠道灌洗液先低速离心（200-500 g 离心 5 min）收集上清液，然后将上清液 12,000 g 离心 10 min，弃上清保留沉淀，然后将沉淀管装入自封袋密封，放入-80℃冰箱保存。2.5直肠棉拭子法
①不易获得粪便时，可采用直肠拭子法进行肠道微生物样本的采集。②使用肥皂、水和 70%的酒精分别清洁肛门周围，然后将无菌拭子用生理盐水湿润后插入肛门 4~5 cm （幼儿 2~3 cm） 肛门括约肌处轻柔的旋转，于肛门隐窝处取样（拭子上明显可见粪便痕迹），每个样本提供 3-5 个棉拭子。③然后插入无菌冻存管（或将棉拭子头部剪落入冻存管中），旋紧盖子，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时 间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。2.6 口腔试纸或棉拭纸
①24h 内不刷牙，取样前 1 h，不要进食、吸烟、饮水、饮酒或嚼口香糖等。③采样用无菌棉拭子可用无菌生理盐水润湿，以增加微生物附着率。将拭子伸进左侧口腔，使拭子头部充分接触左侧脸颊 内部/左侧上下牙床处粘膜，用刷牙的力度上下擦动，同时旋转拭子，让拭子头部充分接触口腔粘膜。采集 2~3 根拭子。④用同样的方法在右侧脸颊内部/右侧上下牙床处粘膜处进行拭子的取样。采集 2~3 根拭子。⑤左右口腔拭子各一根插入同一个无菌冻存管（或将棉拭子头部剪落入冻存管中），旋紧盖子，马上放入装有碎冰或冰袋 的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。一式 2 到 3 管。①取样前 1 h，不要进食、饮水、饮酒、吸烟或嚼口香糖，建议晨起取样。②受试者需要至少在口腔中分泌收集唾液 1 min。打开无菌唾液采集器，采集唾液。此过程需要重复多次采集到 2-5 mL 唾液（不含泡沫部分）。马上置入-80 °C 冰箱保存。2.8鼻腔样本
①利用无菌的棉拭子在左侧鼻前孔黏膜层（约 2.5 cm 处）轻轻旋转式擦拭 2 次，蘸取黏膜上分泌物，缓慢抽出。采集2~3 根拭子。②用同样的方法在右侧鼻前孔黏膜层采样。采集 2~3 根拭子。③左右鼻腔拭子各一根插入无菌冻存管（或将棉拭子头部剪落入冻存管中），旋紧盖子，马上放入装有碎冰或冰袋的保温 盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。一式 2 到 3 管。2.9皮肤样本
①取样前 24 h 不能洗澡，不能使用润肤乳及抗菌活性的肥皂等；取样前 7 d 不能使用抗菌成分的沐浴用品。②将生理盐水浸湿的无菌棉拭子按在取样表面上，用力使其弯曲与擦拭表面成 45 度，平稳而缓慢地擦拭取样表面（取样 区域为 4 cm2）。翻转棉拭子，让拭子的另一面也进行擦拭，但与前次擦拭移动方向垂直。采集 5~6 根拭子。③擦拭完成后，将每个取样点的拭子集中插入同一个无菌冻存管（或将拭子头部剪落入冻存管中），旋紧盖子，马上放入 装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。2.10乳汁样本
低速离心，200g，5-10min，避开上层脂肪层，吸取下层液体，根据需要过 0.22μm 可拆卸的滤膜或高速离心收集菌 体（也可≥8000 g 离心 10min 收集沉淀，但是不推荐，具体情况请根据实验室条件决定），富集的菌体管马上放入装有碎冰 或冰袋的保温盒中，尽快（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。2.11尿液样本
①采集尿液之前用中性肥皂水或者清水对尿道口周围进行清洁。② 采集受试者晨尿的中段尿液 50 mL 左右（中段尿：在排尿过程中，弃去前、后时段排出的尿液，以无菌容器收集中间 时段的尿液；或在开始排尿 3 S 后采集尿液，当尿液量达到 50 mL，即认为完成收集）。③将尿液样本马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 1 h）送至实验室进行菌体富集。尿液在 4 ℃， 10,000 g 离心 5 min 富集菌体。将沉淀立即置于-80 ℃保存。2.12生殖道样本
48h 内无性行为，不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为，30d 内不能用抗生素和抗真菌类药物。将采样拭子 伸入需要取样部位，轻轻旋转 3-5 圈，慢慢取出。采集 2~3 根拭子。将拭子插入无菌冻存管（或将拭子头部剪落入冻存管中）， 旋紧盖子，马上放入装有碎冰或冰袋的保温盒中，在最短时间（最长不超过 4h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80℃保存。2.13 呼吸道样本（肺泡灌洗液等）
呼吸道由鼻腔、鼻咽、口咽、气管和肺构成。呼吸道呼吸到的空气颗粒物，粒径大于 10μm 沉积在上呼吸道，粒径小于1 μm 的颗粒会沉积在肺部，其中粒径大于 0.4 μm 的颗粒会包含微生物和病毒。呼吸道中鼻腔和鼻咽部分的微生物含量大约为 1000 菌体/拭子，口咽微生物含量最高，能够达到 106 菌体/mL 口腔漱液，肺泡灌洗液微生物含量最少，大约在 100 菌体/mL 肺泡灌洗液（Nat Rev Microbiol. 2017; 15(5): 259-270.）。样本采集方法详见联川生物专门整理的长达 4 页的《联川 生物-呼吸道微生物取样方法》。2.14 胎盘
①根据标准的产科实践，将受试者胎盘分娩后，清楚胎盘表面母体蜕膜和胎儿的绒毛膜/羊膜并丢弃（避 免在递送期间或 者样本运输期间发生相关污染），立即放置无菌干净容器中，转置无菌实验室（若胎盘分娩在手术室内，也可在手术室 内洁净区域进行取样）；②从胎盘的不同区域周向切除 6 个 1cm×1cm×1cm 的立方形切片，每个区域距离脐带插入部位 4cm；③取样至耐-192℃低温的冻存管或进口 EP 管（用封口膜牢牢封住），液氮速冻为可选项，-80℃保存，干冰寄送。胎盘样本切片由病理实验丰富人员带着面罩和无菌手套，采用无菌手术刀和器械进行切除。另外从胎盘分娩到样 品取完最好控制在 1h 以内。2.15 痰液（必须由客户自行提取好 DNA 后寄送）
自然咳痰法：患者晨起后，用温开水或无菌生理盐水漱口 3 次，以减少常居菌的污染，然后用力咳出深部痰液于无菌痰杯中， 密封后送检。采集痰量不能少于 2mL。勿留取唾液和鼻咽腔分泌物。诱导咳痰法：对咳痰困难者，先用湿牙刷清洁口腔粘膜、牙龈和舌，无菌水或生理盐水漱口，然后用雾化吸入 20-30mL3%NaCl， 最后用无菌容器收集诱导痰液样本。气管镜采集法：用支气管镜在肺内病灶附近用导管吸引或用支气管刷直接取得痰液样本。小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将棉拭子伸入咽部，小儿受到刺激喷出肺部或气管分泌物粘贴在拭子上。注意事项：b.最好在应用抗菌药物之前或者抗菌药物停药一周后采集样本 c. 样本采集后，液氮速冻，置于-80℃冰箱内低温保存d. 联川实验室不接收痰液样本，请提取好 DNA 再送样。推荐试剂盒品牌包括 Omega 和 Qiagen 专用病原微生物 DNA 提取试 剂盒。3.1 大中型动物粪便样本的采集
①在清晨集中采食时或采食后不久的一段时间后，收集新鲜的粪便样本。②用无菌的粪便取样器（如无菌棉签）进行粪便样本的取样。因粪便表层含有肠粘膜脱落细胞，而外部容易污染，且接触 空气后，部分细菌 DNA 开始降解，所以取样时要截取中段内部的粪便样本（200~500 mg），并立即置于无菌的 2 mL 冻存 管中，用封口膜封口，每个样本取 3-5 管备份。尽量避免粘连沙土和碎石，同时尽可能不要取较稀或尿液过多的部分。样本采集分装好后，马上放入装有碎冰或冰袋的 保温盒中，在最短时间（最长不超过 4 h）送至实验室进行 DNA 抽提或-80 ℃保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融， 以免影响后续实验结果。3.2 小型动物（如小鼠）颗粒粪便样本采集
①实验动物饲养在独立通风笼中，取样前在笼子里铺上消毒滤纸。
②在指定时间内收集小动物的新鲜粪便（小鼠 ≥ 5 粒，大鼠 ≥ 3 粒，约 100~200 mg），装入无菌的 2 mL 冻存管中，③样本采集分装好后，立即置入-80 ℃冰箱保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融，以免影响后续实验结果。辅助材料——16s/宏基因组动物粪便收集方法
超净工作台灭菌 15 分钟，通风 5 分钟，酒精擦拭工作台桌面（实在没有超净工作台就尽可能找洁净的场所，尽量避免 外源菌污染）; 在无菌冻存管管盖和管壁上都写上样品名称，注意，样品名称只能用英文字母或阿拉伯数字或两者的组合， 而且字符数不小于 3 且不大于 9；腹部按摩法促使动物（以大鼠为例）在超净工作台排便，至少两粒到三粒粪便，有条件要 做好备份。其中一份送给公司，另一份自己保存在-80℃冰箱备用；如果是小鼠，粪便粒数加倍，其他动物粪便量参考大鼠即 可；根据分组等情况，将冻存管保存在自封袋中，自封袋缓存在冰上，以避免菌群生长；酒精擦拭工作台桌面，继续取样。样品采集后 2 小时内保存到-80℃冰箱。注意，有条件的话冻存管采集完粪便样本后可以液氮速冻1h。3.3 肠道内容物
①待实验对象死亡后，在无菌操作台或灭菌环境下用无菌解剖刀取出整个肠道，切取所需肠段。②用无菌手术刀挖取内容物，装入无菌 2 mL 冻存管中（100-200 mg/管），每个样本取 3-5 管备份；收集样本时，若 肠道粘膜或者粘液含量较多会影响提取和扩增，所以样本收集时一定要将内容物刮出置于收集管中。若只剪开肠道， 久置肠道粘膜或粘液会与肠道内容物浸泡在一块，后期取样不好分离，影响实验结果。③对于肠道极小的动物，如无法用解剖刀剪等工具挖取内容物，可采用无菌注射器或移液器吸取少量无菌生理盐水，将 注射器针头或移液器吸头插入肠道中，将内容物冲出的方式收集样本。若冲洗后的液体较多可通过离心富集沉淀。④样本采集分装好后，立即置入-80 ℃冰箱保存。注意在样本冻存期间，请勿反复冻融，以免影响后续实验结果。3.4 肠道组织
方法1：肠道样本用无菌 PBS 缓冲液轻轻清洗，直到没有内容物流出；用无菌的显微镜玻片刮取附着在表面的组织细菌进行 DNA 的提取。方法2：取相应肠段样本，在无菌操作台上用灭菌解剖刀或剪刀切取指甲盖大小（1cm2 左右）的组织块，放入离心管中。上述操作完成后，迅速放入液氮中 1 h 以上，然后置入-80°C 保存。3.5 瘤胃样本
①采集前，试验动物须进行 15 天以上的预饲，采集时间根据具体研究内容而定，避免在刚采食饮水后进行。②通过瘤胃瘘管法、口或鼻插入胃管法、穿刺法，收取瘤胃液内容物（10-15 mL），通过四层无菌纱布过滤，滤液采用 12,000g 离心 10 min，收集沉淀。由于该类样本很容易降解，因此需立刻置于-80℃或者液氮保存便于后续 DNA 的 提取。4.1 植物内生菌
①根据研究选取新鲜植物组织（2~5 g），用无菌水清洗除去植物样本表面的杂物。②再依次用 70%无水乙醇和 2.5%次氯酸钠，浸泡 40 s 和 10 min，每 100 mL 2.5%次氯酸钠加一滴吐温 80。③无菌水清洗 2-3 次，至消毒液彻底去除，最后用灭菌滤纸将水分吸干。将组织置于液氮速冻 1 h 以上，转至-80 ℃保存。④如条件允许，可取最后一次漂洗液涂布于平板以检测表面消毒是否彻底。4.2 根表面菌
将所研究的样本放在无菌容器当中，加入 PBS 缓冲液（完全淹没样本）后进行振荡，使得微生物从根表面充分的脱落 并聚集在 PBS 缓冲液当中，震荡至少 2 h 以上。将缓冲液用 0.22 μm 滤膜过滤，将滤膜装入合适的冻存管液氮速冻 1 h 以 上，转至-80 ℃保存。4.3 叶外生菌
用灭菌剪刀裁剪得到等重量的叶片，置于装有 PBS 缓冲液的无菌离心管中静置一段时间，离心去上清液，加 1 mL 缓冲液重悬，液氮速冻，置于-80℃保存。若样本量大，可用无菌医用棉签 2 至 3 根经缓冲液湿润后在叶表面擦拭，后在装有磷 酸盐缓冲液的离心管中搅动，离心去上清，再用 1 mL 缓冲液重悬，液氮速冻 1 h 以上，转至-80 ℃保存。4.4 茎外生菌
对植物茎片段使用无菌水振荡（或超声波）洗涤多次，收集洗涤液以 0.22 μm 滤膜过滤，将滤膜装入合适的冻存管液 氮速冻 1 h 以上，转至-80 ℃保存。。土壤采样前期准备之器具准备
为了采样顺利开展，请提前准备好以下采样器具以及其他所需材料。采样工具和盛放土壤样本的容器必须提前灭菌（锡 箔纸包裹，高压蒸汽灭菌后，120 ℃烘箱过夜），避免外源物质干扰。采样位置选择 根据研究目的，进行采样点的选择，采样点的选择应遵循以下原则：a)采样点土壤类型特征明确，地形相对平坦、稳定，植被良好。b)坡脚、洼地等具有从属景观特征的地点不宜设置采样点。c)城镇、住宅、围墙、道路、沟渠、田埂、粪坑、堆肥点、坟墓等地人为干扰大，可能造成土壤特性错乱，使土壤失去代 表性，不易设置采样点。e)采样点以剖面发育完整、层次较清楚、无侵入体为准，不在水土流失严重或者表土被破坏处设采样点。f)不在多种土类、多种母质交错分布、面积较小的边缘地区布设采样点。注意事项：确定采样点后可以使用精准地图或者 GPS 进行采样点定位，或者在采样点进行标记，便于以后重复取样或者进行 比较试验。取样方法设置 注意！同一次实验，采用同一种取样方法。5.1 普通土壤
①去除土壤上面的覆盖物，包括植物、苔藓、可见根系、凋落物以及可见的土壤动物等。②对采样器使用酒精棉擦拭，待酒精挥发完全后，可使用采样样方处土壤浸润采样器。后续每次更换样方均需重复此步③同一样方多点混合取样（建议 3-5 个点等量混合），去除样本中的植物、可见动物以及石粒等，然后根据土壤情况，选 择是否过筛，1）推荐过 2 mm 筛；2）一些有机质（如粗腐殖质或泥炭等）不能通过 2 mm 筛，此时可以选择过 4-5 mm 筛；3）如果土壤粘度太大或者含水量太高，可以选择不过筛。④将混合好的土壤样本，分装多份，每份 3-5 g，液氮速冻（如果条件不允许，可以选择放在冰盒中，尽快运回实验室）， 随后转移至-80 ℃冰箱保存，用于测定土壤微生物；另外留出一部分土壤，用于测定土壤理化指标（如有机质、全氮、 矿质元素等）5.2 根际土壤 作物类（含草地等矮小植物）根际土壤
①采集植物植株，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室。②晃动根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤。③同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻 1 h 以上，置于-80 ℃冰箱保存。林木类根际土壤
①采集地面下 10-20 cm 根际土壤，置于冰上运输至实验室。③ 同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后，液氮速冻 1 h 以上，置于-80 ℃冰箱 保存。5.3活性污泥/沉积物类
同一活性污泥装置，进行多点取样并等量均匀混合至约 10 mL 的悬浮污泥样本或 5-10 g 沉降物，保存无菌冻存管，液 氮速冻或冰/干冰避光运回实验室，置于-80 ℃保存。若液态污泥样本沉降物较少，需加大取样量。5.4水体/地表沉积物
主要包括城市、河流、管道污泥，海底、江河、湖泊、冰川等环境沉积物。使用重力取样器取距离水底/地表 0-10 cm（具体按实验目的而定）沉积物（底泥）5-10 g，保存无菌冻存管中，液氮速冻或冰/干冰避光运回实验室，置于-80 ℃保存。5.5岩石、砂砾类、岩石
①取 10 根经无菌水湿润的消毒棉签，擦拭岩石表面，面积约 35 cm2，保留拭子放入无菌离心管（可事先装入 6 mL 无菌 水），置于冰上运送至实验室。②将样本超声 20 s，接着涡旋 1 min，再超声 20 s，无菌移除拭子，18000 ×g 离心 10 min，去上清，收集沉淀，进行 DNA 提取。拭子数量和擦拭面积可依实际情况酌情增减。沙石
①无菌采集沙石样本保存无菌袋或冻存管中，置于冰上运送至实验室。②使用 50 mL 无菌水浸没沙石，大力晃动数秒（或低速离心孵育一定时间），收集液体，使用 0.22 μm 孔径滤膜过滤，将 滤膜样本置于无菌冻存管中，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。为了采样顺利开展，请提前准备好以下采样器具以及其他所需材料。采样工具和盛放水体样本的容器必须提前灭菌（如 锡箔纸包裹，高压蒸汽灭菌后，120 ℃烘箱过夜），避免外源物质干扰。a)普通采样器：在进行河、湖或者是海洋等表层水体采样时，可以使用处理后的塑料瓶即可b)排空式采样器：一种手动简便易行的采样器，该采样器可以沉入预定的深度进行特定深度水体样本的采集 c) 多通道综合深度采样器：此类设备可以用于深海水体样本的采集，保证水体样本微生物群落结构的稳定采样容器洗涤
容器洗涤：将容器用水和洗涤剂清洗除灰尘、油污后，用自来水冲洗干净，再用 10%的硝酸或盐酸浸泡 8 h，取出后 用自来水冲洗 3 次，最后用蒸馏水充分淋洗干净。容器灭菌：高温高压灭菌，并及时烘干容器；如果无法灭菌，可以使用 75%酒精和无菌水反复冲洗。注意事项：处理后的容器应在 2 周内使用；更换样地进行样本采集前，使用酒精对仪器设备进行消毒灭菌处理，或者使用样 地水体对仪器设备进行润洗。水体取样方案
a.样本采集：水体的取样深度和范围可以根据实验目的进行确定选择，并采用相应的采样器进行样本采集。b.样本处理：根据实验设置，选取适当孔径的滤膜，使用水体抽滤机抽滤 1~100 L 水体（不同水质间差异极大），或抽滤 至滤膜上可见明显覆盖物。收集滤膜进行 DNA 提取或置于-80 ℃冰箱保存。注意事项：根据水体中微生物含量，依据项目经验，污水等菌群丰富的水体用量一般为 200-1000 mL，湖泊、河流等自然水体一般为 1-2 L，自来水等菌群含量较低的水体则一般为 1-5 L，甚至更多。如果体积超过 2mL，且细菌含量较低，需要全部 上样提取，则不可直接冻存后送公司，因为冻融过程中液体里的细菌极可能破裂，到公司后通过离心或者过膜收集菌体时已 经无法收集到已经破裂的菌体。正确的处理方法是在样品冻融前进行离心或过膜处理，将滤膜或者离心得到的沉淀送到公司滤膜选择
滤膜孔径大小选择（不同材料有不同的界定，下述数据仅供参考）0.8 to 5 μm 适用于超 微浮 游 生物 （ Piconanoplankton）；5 to 20 μm 适用于微型浮游生物（Nanoplankton）；20 to 180 μm 适用于小型浮游生物（Microplankton）；180 to 2000 μm 适用于中型浮游生物（Mesoplankton）；抽滤操作
通常情况下，对环境水体微生物进行检测之前，需要通过抽滤装置对水体样本中的微生物进行富集，具体抽滤装置如上 图。抽滤时，先将真空泵打开，然后将环境水体倒入，当滤膜表面有可见覆盖物后，可以停止加样。抽滤结束后，先拔掉抽 滤管，再关闭抽滤泵，防止倒吸。用镊子将滤膜取出，放入冻存管中，保存于-80 ℃冰箱。尽量使用 1 张滤膜进行样本富集。离心处理
a)通常情况下，环境水体样本的富集推荐使用真空抽滤的方法，如果样本浑浊度很大或者没有抽滤装置，可以考虑使用离 心的方法进行富集。此方法只作为备选方法，不推荐使用。b)水体样本浑浊度较大的情况下，可以使用小型离心管，离心 2-6 mL 样本后送沉淀物（管底要有一定量的沉淀物），13000 g 离心 5-10 min。c)水体比较澄清的情况下，需要加大离心的样本量，这时可以使用大离心管，离心 50-100 mL 甚至更多体积的样本，送 样标准依然是以底部有一定量的可见沉淀物为准。通常大型离心机的转速不是很高，可以适当的增加离心的时间。对于水质较为混浊的（微生物含量较为丰富的发酵液）水体，三点取样混合摇匀。取 8-10mL 分装至两个耐-192℃超 低温的无菌 5mL 离心管中，每个分装 4mL（注意不要分装过满，防止水样冻存体积膨胀致使离心管破裂，被其他微生物群 体污染），液氮速冻，-80℃保存a)对于空气样本采集，建议使用专门的空气收集仪器，使用时注意对专用采样仪器的进样头、切割头和膜托等关键部位进 行清洗。b)空气收集仪器的采样模式大概分为两种，一种是无菌滤膜收集方法，另一种是液体撞击式收集方法；其中无菌滤膜收集方法，可将无菌滤膜置于采样器中（滤膜材质为玻璃纤维，直径 80 mm），空气流量为 100 L/min，采集后用无菌水或 PBS 缓冲液冲洗滤膜，将滤膜上沉积颗粒物溶于其中，后续对液体 12000 r/min 离心 20 min，取沉淀提取 DNA 即可；另外液体撞击收集方法，建议用无菌水或者 PBS 缓冲液作为样本吸附液，收集完后，对含有空气微生物的吸附液进行 离心或者过滤浓缩的方法提取 DNA 即可。c)对于无菌滤膜收集方法，可以通过寄送滤膜的形式将收集的空气微生物样本运往公司，运输途中建议干冰寄送，干冰需 要 5-10 kg；d)对于液体撞击收集方法，可以通过将吸附液，吸附液的体积不能大于 500 mL；或者将吸附液过滤后的滤膜寄送，过滤 的步骤可以参照灌溉水样的样本采集流程；样本运输建议干冰寄送，干冰需要 5-10 kg。a)将收集好的样本置于相应的收集管中，为防止样本混淆管盖和管壁均要书写编号，并用封口膜封口；b)将样本放入自封袋中，在样本提交单上填好样本详细信息（编号等信息必须严格与样本管上一致），将填好的样本单和样本一起放入装有冰袋（最好有少量干冰）的合适泡沫箱中；c)选用大小合适、箱壁大于 4 cm 且密封性良好的泡沫箱，并在泡沫箱外纵横方向都缠上透明胶，防止泡沫箱在运输过程 中的开裂。①菌液体培养物混匀，取 3ml 入 15ml 离心管，加入 7ml 无水乙醇混匀（至乙醇终浓度为 70%）室温处理 2 小时；②4500g 离心 10min，沉淀菌体，弃上清；③加入 1-1.5ml 无菌 PBS 或生理盐水重悬，转移至 1.5ml 离心管，8000g 离心，10min，弃上清；④再加入 1ml 无菌 PBS 或生理盐水重悬，再次 8000g 离心，10min，弃上清；注意：上述体积可根据实际情况调整，需要注意的是，不论体积如何，加入乙醇使终浓度 70%-75%，加入的菌 PBS 或生理 盐水的作用是去除残余的乙醇，可增大体积或增加洗涤次数。联川生物对细菌真菌 RNA 提取有独特的方法，如客户需要，联川生物实验室可以通过销售或项目管理申请，向客户提 供两种试剂（溶液 A，溶液 B），对致病菌样品进行预处理。该步骤仅适用于做 RNA 项目的样品。
处理流程主要包括：8000g 离心 10min 收集菌体（约 10-50mg，不超过半颗黄豆大小，如超过，则需要增加加入溶 液量），加入 500μL 溶液 A 重悬，加入 500ul 溶液 B，剧烈震荡混匀，（AB 不互溶需要剧烈震荡为乳浊液，防止分层）。-80℃ 保存，干冰运输。不同地域土壤，极低海拔或高海拔地区；不同处理土壤，如追肥、足灌、耕作方式、污染程度等；根系及非根系土壤，研究根际及非根际，根表及根内微生物等。（1）采样所用工具或其他物品都要事先灭菌，或用采取的土壤擦拭。（2）取5-10 cm处普通土壤，针对际土壤，需采集20 cm深的土壤于50mL的无菌管里，多点采取重量相当的土壤进行混匀，去除杂质后再取一定量土壤装入无菌管，每个样品取样2-10g，迅速放在液氮里冻存。（3）密封后用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。不同类型污泥，如水池、沼气池、生物电池等；不同处理污泥，如地域、深度、污染程度等。（1）活性污泥样本取自活性污泥装置中，一般取样量大于20ml，将其置于无菌管中，建议立即提取后-80℃保存。（2）海洋沉积样本根据研究目的进行取样，一般建议取50g 以上的沉积物装入冻存管中，低温运输并尽快进行提取-80℃保存。注意事项：活性污泥样本等一般建议及时提取，样本体积较大，长时间-80℃保存，主要是冻融提取比较困难，加大了实验工作量及难度。建议提取后保存RNA即可。针对固体样品可以直接冻存送样。建议使用RNA保护剂保存，具体方法如下：（1）每克土壤加入2~2.5倍体积保护液，如1g土壤中加入2~2.5 ml保护液。注意：若对象是底泥沉积物样品，每克湿重样品请加3倍体积保护液。（2）涡旋或手工摇匀，使样品与溶液混匀，保护液液面应当高于土样层。根据情况-20℃、4℃或室温保存。（3）提取样本RNA时，2500×g离心5min，移除Tube管中的保护液，收集土样。备注：常用保护液为LifeGuardTM Soil Preservation Solution或RNAprotect Bacteria Reagent。（1）采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤膜，对于澄清水体或者略浑浊水体，选用0.22μm或者0.45 μm的滤膜，取样体积大于5L。（2）对于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤。（3）将滤膜冻干后，用大体积干冰运输，且要保证我方在收到样品开箱检验时有足够的干冰剩余。