同样是peak calling工具，为什么我们pick它

什么是peak

我们都知道RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation）是RNA结合蛋白免疫共沉淀。顾名思义，是进行RNA结合蛋白（RBP）与RNA之间的研究。利用免疫共沉淀的方法将蛋白-RNA复合物拉下来，将RNA结合蛋白所结合的RNA提取出来，并对其进行高通量测序，鉴定出基因和蛋白结合位点，那么将会对RNA与蛋白质相互作用在调节mRNA和非编码RNA功能方面提供研究的途径。

理想情况下，通过RIP对目的蛋白结合的RNA进行富集后，目的蛋白结合的RNA或者目的蛋白在RNA上的结合区域，在对应的参考基因组位置上，测序reads的覆盖度会显著升高，相对其他非结合区域形成明显的“peak“。所以，通过测序数据检测peak，可以获知目的蛋白结合的RNA，以及可能的结合的区域等信息。

为什么是RIPSeeker

RIPSeeker是一个基于隐马尔可夫模型进行从头RIP峰预测的免费开源Bioconductor/R程序包，有着较高的敏感性和特异性。RIPSeeker区分正负链，可以鉴定链特异性的peak区域，有利于链特异性非编码RNA的鉴定。并且，RIPSeeker不局限于鉴定狭义上的peak区域，其适用于检测更大范围的峰值分布，以鉴定不同长度范围分布的整条结合转录本。所以，这也是为什么进行RIP-seq数据分析的时候，我们选择RIPSeeker的主要原因。不同于其他的peak calling方式，可以说RIPSeeker是为RIP-seq量身定做的。

虽然RIP-seq实验和ChIP-seq以及RNA-seq有着相似之处，但是RIP-seq有一个最根本不同的目标，就是发现目的结合蛋白相关的转录本。如上图所示，展示了3种不同模式下的比较。在ChIP-seq中，目的蛋白结合的双链DNA被抗体拉下来，然后进行高通量测序。由于reads通常短于双链DNA片段，测序数据会显示出一个特性，即真正的结合位点，会在与片段长度接近的一个距离d上，产生正负链的一个对称峰，如上图（a）所示。而由于RNA转录本是单链的，在ChIP-seq中观察到的双链DNA的双峰性质就不适用于RNA-seq和RIP-seq。因此，也就不适合用通过查找这种双峰的模式来进行RIP-seq的分析。并且，针对RNA来说，我们还需要考虑到剪切比对的形式，因为剪切事件的存在，也不能跟双链DNA的模式相同，比对reads不能直接沿着基因组延伸。

Peak calling 方法比较

RIPSeeker的作者，将RIPSeeker与各种高通量测序分析中流行的其他算法进行了比较。作者选择了三种ChIP-seq算法，包括MACS、QuEST和HPeak；两种RNA-seq算法Cufflinks+Cuffdiff和Rulebased算法和一种PAR-CLIP算法PARalyzer。

通过各方法的比较，发现对于相同的数据来源，所得到的峰的个数差别很大。这可能是由于不同方法之间使用的打分规则和peak长度不同。MACS在ENCODE数据上表现出来是检测的峰数量更多，这是由于别的方法在很大程度上会将接近的peak峰区段连接成一段较长的连续区间。针对RIPSeeker和个别其他方法来说，针对两个生物学重复，它们鉴定得到的peak重复度一般高于50%(如下图柱状图灰色部分)。

用同一目的蛋白富集的数据，使用两种不同的对照进行分析，来研究RIPSeeker的鲁棒性。作者针对同一细胞系的同一RIP处理组，分别将非特异性抗体富集的结果（T7Tag）和RIP input作为阴性对照，得到约60-80%的重合率。这也意味着，两种不同的对照条件可以交换使用。

为了比较不同方法之间结果异质性，作者使用同一数据集，对任意两种方法的结果重叠情况进行了比较。结果显示，RIPSeeker和其他方法之间有比较好的结果重叠（一般>50%）。

基于敏感度和特异性的ROC评价显示，RIPSeeker在大多数测试中占主导地位。RIPSeeker在识别信号峰方面的敏感度和特异性优于其他方法。

为了证明RIPSeeker软件包的实用性，作者将RIPSeeker和其他发表的6个方法工具，作用于3个RIP-seq数据集和2个PAR-CLIP数据集。基于受试者曲线，RIPSeeker表现出优越的敏感性和特异性。来自RIPSeeker鉴定所得的峰，在后续的生物学研究中，通过特定基因组元件的富集情况、已发表的一些motif结果、与目的蛋白相关的典型转录本等，被进一步证实。

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