Nat Microbiol：根际微生物对铁的竞争驱动病原体的控制 | 微生物专题

写在前面：每次看到LorMe实验室的最新成果，都情不自禁的惊喜与叹服，对于病原菌-根际微生物组-植物间的相互作用我认为是：当病原菌入侵时会触发植物特定的分子免疫识别系统，植物释放出特定的分泌物去招募有益微生物去抵抗病原菌的入侵。在根际主要发生两种经常报道的情况:①有益微生物组释放代谢产物直接抑制与灭杀病原菌。②有益微生物通过与病原菌进行资源上的竞争从而来抵御病原菌的入侵。本文就是在第二个背景下发现铁载体是二者战役的“核武器”。这篇佳作的工作量十分大，能够成功完成让我们看到的不只是作者的辛勤努力，更有团队协作下的共赢。

什么是铁载体？

铁载体在互作中的作用。（图片来源：南农LorMe）

题目: Competition for iron drives phytopathogen control by natural rhizosphere microbiomes

天然根际微生物对铁的竞争驱动植物病原体的控制

期刊：Nature Microbiology

上线时间：2020年5月11日

三年均IF：14.404

第一作者：顾少华

通讯作者:韦中 徐阳春

摘要

植物病原菌对人类社会造成了巨大的经济损失。这些病原体的感染很难控制，因为它们常常是通过植物、病原体和植物微生物群之间的复杂相互作用产生的。对这一自然生态系统在微生物群范围内的实验研究很少，因此我们对分类和功能微生物群的组成以及由此产生的生态相互作用如何影响病原体的生长和疾病的爆发缺乏了解。在这里，我们将基于DNA的土壤微生物组分析与体外和植物体内的生物测定相结合，以表明通过分泌的铁载体分子竞争铁是微生物-病原体相互作用和植物保护的良好预测因子。我们检测了80个根际微生物群中2150个细菌个体的能力，涵盖了所有主要的系统发育谱系，以抑制细菌Ralstonia solanacearum，一种能够感染各种作物的全球植物病原菌。我们发现分泌的铁载体改变了微生物-病原体的相互作用，从完全的病原体抑制到强烈的促进作用。具有生长抑制性铁载体的根际微生物组常能在体外及自然和温室土壤中抑制病原菌，保护番茄植株免受侵染。相反，具有促进生长的铁载体的根际微生物群成员往往在竞争中处于劣势，并促进了病原菌对植物的侵染。由于铁载体是一组化学性质不同的分子，每一种铁载体类型都依赖于一个可兼容的铁摄取受体，我们的结果表明，病原体抑制微生物组成员产生了病原体不能使用的铁载体。我们的研究建立了微生物组水平的铁竞争和植物保护之间的因果机制联系，并为利用铁载体介导的相互作用作为微生物组工程和病原体控制的工具开辟了有希望的途径。

背景

1.过去的研究可分两条线。第一条线研究使用了比较的方法来揭示微生物群结构和假定的流行性抑制病原体特性的与植物健康的关系。第二条线关注于特定的系统，以机械测试抗生物、资源竞争和植物免疫激活等因素是否会影响植物保护。因此，目前还不清楚哪些细菌类群和根际生态相互作用的类型决定了土壤传播病原体的疾病结果。

2. 铁是许多酶的必需辅因子，但它在大多数土壤中的生物利用度较低，因为铁主要存在于其不溶性铁（III）中。许多细菌通过分泌对铁有高度亲和力的一组化学上不同的次生代谢物的铁载体从环境中清除铁。铁离子通过铁载体利用菌株特异性受体吸收铁离子，而铁载体可以促进和抑制竞争对手，这取决于竞争对手是否拥有与之匹配的铁载体吸收受体。

3.通过分泌铁载体从环境中清除铁的理论基础，我们假设对铁的竞争可以代表一种普遍的机制，决定土壤微生物组分在多大程度上可以抑制病原体和保护植物。尽管其他机制，包括资源竞争或抗菌作用，也可能涉及到细菌的相互作用，但我们推断由于铁对细菌生长的普遍重要性，这些机制可能被对铁的竞争所取代。

实验设计

1. 采集根际土:4个地理位置较远的地区采集番茄单株根际土壤样品。每个地采集了20份根际土壤样品（20株番茄植株）。将根际土壤样品分为两部分：一部分分离细菌，另一部分提取DNA进行细菌群落16srRNA基因测序，并用qPCR定量测定茄青枯病菌密度。测量土壤pH值，因为土壤pH值低与土壤中铁的生物有效性正相关。

2.分离菌株：从80个根际土壤样品中分离出2150株细菌。根际细菌分离株的树构建及系统发育分析。

3. 根际细菌生长及其产铁量的测定

将所有菌株在富铁与缺铁培养基上生长，测定其细菌生长密度与铁含量。

4.体外根际细菌与病原菌的互作：

病原菌暴露于以下三个处理中（1）从富铁条件下收集的上清液（在富铁MKB培养基中生长的根细菌，其中产生少量铁载体，但分泌其他化合物；SNri），（2）从铁限制条件下收集的上清液（在富铁MKB培养基中生长的根细菌，除其他分泌化合物外，还可触发铁载体的产生；SNli）和（3）从铁限制条件下收集的上清液，随后用50μM FeCl3（SNre）补充。上清液中仍含有铁粒，但它们与铁的吸收不再相关，因为铁可供过量使用。作为对照，我们用消毒水代替上清液（SNcontrol）。测定病原菌生长密度。GEtreatment=（（SNtreatment÷SNcontrol）–1）×100，其中SNtreatment是SNli、SNri或SNre。

5.外源铁载体对蕃茄青枯病菌生长的影响。

验证外源铁载体对病原菌生长的影响。首先，由于铁载体合成基因（PAO1ΔpvdDΔpchEF和H111ΔorbJΔpchAB）的工程缺失而无法产生铁载体我们使用与前面描述的相同的方法从两个确定的铁载体产生者处获得铁限制上清液（一式三份）（铜绿假单胞菌PAO1和B.cenocepacia H111）及其等基因零突变株。然后，我们遵循前面描述的方案，用这些上清液挑战病原体，以测试是否仅用野生型菌株的上清液而不是用缺乏铁载体的菌株的上清液抑制病原体生长。

6. 研究铁限制对青枯菌QL-Rs1115生长和产铁量的影响。

我们进行了三个额外的对照试验，以验证病原菌R.solanacearum QL-Rs1115本身在MKB培养基中受到铁的限制，在铁限制条件下产生铁载体，并受到自身含铁载体的铁限制上清液的刺激。（1）添加50μM FeCl3（高铁利用率）的MKB培养基，（2）添加200μM 2,2′-联吡啶的MKB培养基（低铁利用率）和（3）添加200μM 2,2′-联吡啶的MKB培养基，一种强铁螯合剂（非常低铁的可用性）。测定病原菌生长量。然后，我们使用来自铁限制（MKB）和富铁（MKB+铁）培养基的培养物收集无菌上清液，根据前面描述的方案，我们使用CAS分析对其铁载体含量进行量化。

7. 对照实验测试在pH梯度上mCherry荧光是否保持稳定。

由于我们的目的是使用mCherry信号作为与根际分离物混合培养中病原体生长的代表，我们测试了mCherry荧光测量值在6到10的pH范围内是否保持稳定。我们发现细菌培养物的pH值对mCherry荧光强度没有显著影响。

8. 根际细菌对共培养病原菌生长的影响。在铁限制的MKB培养基中与病原菌共同培养每一个根际细菌分离物，该培养基触发铁载体的产生，以测试根细菌产生的铁载体是否直接影响病原菌的生长。为了控制根际细菌的自身荧光，我们还将每个分离物作为单一培养物在铁限制的MKB培养基中培养，并从共同培养的荧光值中减去这些单一培养值。这使我们能够将病原菌密度的变化与每一对病原根细菌的铁载体介导的生长效应联系起来。

9. 田间根际细菌-病原菌共丰度的测定

我们结合病原菌qPCR和根际细菌16srRNA数据，将80个番茄根际样品的病原菌密度与各根际细菌相对丰度相关，得到2150个回归系数。正系数表示根际细菌丰度高时病原菌密度高，负系数表示根际细菌丰度高时病原菌密度低。然后我们将这些回归系数与铁载体介导的病原体生长效应相关联。

10.温室实验

我们进行了一个长达60天的温室试验，以测试铁载体介导的根际生长抑制是否能降低番茄青枯病的发病率。在本实验中，我们随机选择了3个最丰富属的360株根际细菌（分别来自肠杆菌、芽孢杆菌和金黄杆菌分类群的120个菌株）。由于来自芽孢杆菌的铁限制性上清液既有抑制作用（约占所有菌株的三分之一）又有促进作用（约占所有菌株的三分之二），我们随机挑选了40个和80个分别属于这两类的菌株。我们在六个装满生长基质（每孔100g基质）的井盘中培育番茄幼苗，在试验前用伽玛辐射灭菌。无菌种子发芽播种。在三叶期，6株植物分别接种360株根际细菌中的一株，最终浓度为1×10^8（CFU）/g（共2172株）。一周后，以最终浓度为1×10^7 CFU /g的底物将R.solanacearum导入所有植物的根系。此外，我们还进行了两个对照处理，即番茄植株仅用茄青枯菌（无根际细菌）或消毒水（无根际细菌或病原菌）处理。温室试验在接种青枯菌40d后完成，然后从6个植物本中收集根际土壤，提取细菌DNA，并使用前面描述的qPCR量化茄青枯菌密度。

主要图片结果

1.根际细菌产生的铁载体及其对植物病原菌的生长影响

图1:根际细菌产生的铁载体及其对植物病原菌的生长影响。a、 2150株根际分离物（用CAS法测定培养上清）在铁限制（顶部）和富铁（底部）条件下的相对铁载体产量。黑色虚线垂直线显示了两个确定的缺铁突变体（非生产者）上清液中测得的平均CAS值。我们用这条截止线来区分来自铁载体噪声。测量CAS背景很重要，因为该分析还测量上清液中其他有机铁结合化合物的活性。此外，不同物种和收集上清液的培养基之间的截止值可能略有不同）。绿色垂直线代表了我们的模式 病原菌R.solanacearum菌株QL-Rs1115（在铁限制性培养基中的CAS值为0.462）的铁载体生产。b、 在铁限制条件下（顶部），所有菌株的铁载体产生量（以CAS活性测定）与根际细菌生长量（以600 nm处的光密度（OD）测定，OD600）显著相关，表明铁载体对生长很重要。在富铁条件下（底部），这种影响要弱得多。黑色虚线垂直线显示了已定义的铁载体非生产者的背景CAS分析值，黄色和紫色线和阴影区域分别描绘了最佳拟合趋势线和线性回归的95%置信区间。铁限制条件的回归模型（上）：校正 R2 = 0.388, F1,1248 = 1,362与P < 2.2 × 10^−16; 富铁条件（底部）：校正 R2 = 0.039, F1,1248 = 87.7 与双边P < 2.2 × 10^−16。回归基于学生t检验。n = 2150个生物独立的根际细菌菌株。c、 在铁限制（高铁载体浓度 + 其他分泌代谢物）、富铁（低铁载体浓度 + 其他分泌代谢物）和铁限制条件下收集的上清液中测量生长效应（去除铁载体效应，其他代谢物的作用被保留）。通过从铁限制上清液的生长效应中减去补铁上清液的生长效应，获得仅由铁载体引起的净效应（右柱）。这些值表示增长的百分比变化。箱线图包括25-75个百分位，须延伸至最小和最大点，中线表示中值（n = 2150个生物独立的根细菌菌株）。P < 2.2 × 10^−16（左）和P = 0.882（右）基于方差分析，随后进行配对的双边学生t检验。***P < 0.001；NS，不显著。

2.根际细菌分离物的分类单位鉴定及其与蕃茄青枯病菌的系统发育距离影响铁载体介导的病原菌生长效应

图2 ：根际细菌分离物的分类单位鉴定及其与蕃茄青枯病菌的系统发育距离影响铁载体介导的病原菌生长效应。a、 基于16srRNA基因序列的2150株分离株系统发育关系的分支图。第一个内环将铁载体介导的病原菌生长效应描绘为从红色（抑制性）到蓝色（促进性）的热图，第二个内环显示每个分离物产生的相对铁载体，外圈显示最丰富的属（分离物数量大于20个）。SIDE，铁载体介导的病原体生长效应；SID，铁载体产物。（这个a图信息量太大了哈哈） b，18个最常见属的分离株在铁载体产生（顶部）和铁载体介导的病原体生长（底部）方面的差异。黑色虚线显示了铁限制条件下非铁载体生产者的背景CAS测定值。红线上下的数值代表了铁载体介导的根际细菌对病原菌生长的促进和抑制作用。箱线图包含25-75个百分点，须延伸到最小和最大点，中线表示中值。C，铁限制条件下铁载体对病原菌生长的影响、病原菌与根际细菌的系统发育距离以及铁载体生产的关系。这种关系解释了铁限制条件下观察到的高比例的方差（25.6%）（基于广义线性模型分析的热图，背景）。虚线代表已定义的铁载体非生产者的背景CAS分析值。每个点代表2150个分离物中的一个，其颜色阴影表示铁载体介导的病原体生长效应的强度（根据整个模型的学生t检验校正R2 = 0.255、f11248 = 87.7和双边P <2.2 × 10 ^16）。

3.在田间条件下，铁载体介导的病原菌生长效应与青枯病菌和根际细菌在体内外的丰度相关

图3：在田间条件下，铁载体介导的病原菌生长效应与青枯病菌和根际细菌在体内外的丰度相关。a、 在2150株根际细菌与青枯病菌的共培养试验中，病原菌密度（以mCherry荧光单位计）与铁载体介导的生长效应呈正相关，表明铁载体在与根际细菌直接竞争时决定了病原菌的生长。蓝线和灰色阴影区域分别描绘了线性回归的最佳拟合趋势线和95%置信区间（根据学生t检验，校正后的R2 = 0.16，n = 2150个生物独立根际细菌分离株，f11248 = 404.6和双边P <2.2 × 10^- 16）。b、 用80个土壤样品的相关系数估算了病原菌与根际细菌的共生关系，并绘制了铁载体对病原菌生长的影响图。在这些变量之间发现完全负相关，表明产生抑制性铁载体的根际细菌倾向于与病原菌在高密度下共存（正r），而产生促进性铁载体的菌株倾向于在病原菌丰富时在低密度下出现（负r）。插图中，这种关系的强度与四个采样点的土壤pH值相关（右）。左边，颜色代表不同的采样点：CS，长沙（n = 528株生物独立根际细菌，F1526 = 58.72，P <2.2 × 10^−16）；NB，宁波（n = 526株生物独立根际细菌，F1524 = 154.1，P <2.2 × 10^−16）；南昌市（n = 508株生物独立根际细菌，F1506 = 157.1，P < 2.2 × 10^−16）；南宁市（n = 568株生物独立根际细菌，F1566 = 14.9，P = 0.0001）。左面板中的线性回归分析结果显示为每个采样点的彩色编码最佳拟合趋势线（阴影区域表示95%置信区间，并用最佳拟合趋势线的斜率调整R2）。右图显示了校正后的R2 = 0.133和描绘95%置信区间的阴影区域（n = 2130个生物独立的根细菌分离物、f11228 = 272.7和双面P < 2.2 × 10^−16，对四个采样点的基于学生t检验全部数据）。

4.在温室试验期间，铁载体介导的生长效应预测番茄植物根际的植物病害结果和病原菌负荷

图4：在温室试验期间，铁载体介导的生长效应预测番茄植物根际的植物病害结果和病原菌负荷。a、 将病原菌感染番茄植株的能力作为360种病原菌-细菌组合的一个二元变量进行测量；如果6种植物中至少有一种被感染，则认为感染是成功的。感染成功率与铁载体对病原菌生长的影响成正相关，表明抑制性铁载体能保护植物免受感染（n = 360个生物独立的根际细菌分离株和基于卡方检验的双边P = 4.85 × 10^8）。b、 感染植物的病害严重程度（以病害进程曲线下面积（AUDPC））与铁载体介导的病原生长效应呈正相关。在这个分析中，我们只考虑了77个实际能够感染植物的菌株（根据学生t检验，校正后的R2 = 0.149，n = 77个生物独立的根细菌菌株，F1，75 = 14.34和双边P = 0.0003）。c、 病原菌密度与铁载体介导的病原菌生长效应呈正相关，表明铁载体介导效应的信号决定了番茄根际病原菌的负荷（校正后的R2 = 0.105，n = 360个生物独立根际细菌菌株，F1，358 = 42.92和双边P = 6.16 × 10-9，基于学生t-检验）。b、 c、红色和黑色虚线分别表示番茄植株单独接种青枯病菌或消毒水的对照处理的基线值。d、 成功感染与病原菌密度呈显著正相关，表明成功抑制病原菌生长是疾病控制的关键（n = 360株生物独立的根际细菌和基于卡方检验的双边P = 2.31 × 10^-13）。a-d、黑线和灰色阴影区域分别表示logistic回归的最佳拟合趋势线和95%置信区间。AIC，Akaike信息准则。

结论

我们的研究将整体微生物组分分析与高通量实验分析联系起来，以证明铁载体介导的相互作用是在自然条件下影响微生物组分功能的首要机制。我们的发现为微生物群范围内的生态系统工程奠定了基础，以抑制病原体和保护作物。微生物组工程或益生菌的发展的关键组成部分将是有选择地促进对病原菌具有抑制铁载体作用的微生物组的成员，并减少那些具有促进病原菌铁载体的成员。应特别注意选择产生病原菌无法吸收的铁载体的物种。我们的研究已经确定了具有如此良好功能的土壤细菌群；下一步将是通过基因和化学方法鉴定抑制和促进病原体的铁载体。由微生物组的所有成员产生的铁载体类型可以形成一个数据库，根据该数据库，任何致病细菌的铁载体类型都可以被映射，以识别具有不相容铁载体的微生物组的特定成员。我们认为这种铁载体误配分析可以作为微生物介导病原体管理的预测工具。这种方法的一个重要方面是采取措施尽量减少病原体产生耐药性的风险，例如通过水平基因转移获得外源性铁载体受体。在这方面，重要的是促进不同的根际群落，通过分泌一组化学上不同的铁载体，在多方面对抗病原体。可想而知，在病原体面临抑制性铁载体混合物的情况下，抵抗力不可能轻易进化。

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