一作分享土壤学顶刊发文经验：改良剂对土壤ARGs丰度和菌群结构的影响 | 微生物专题

研究主题：铵、硝态氮浓度对土壤抗生素抗性基因丰度和细菌群落结构的影响发表杂志：Soil Biology and Biochemistry中科院杂志分区：大类：农林科学1区[Top]，小类：土壤科学 1区影响因子：5.795发表单位：南京农业大学资源与环境科学学院


样本组成

根据田间施氮水平和供试土壤氮浓度水平，共设7个处理：不加氮（CK）、25 mg kg−1铵态氮（LA）、100 mg kg−1铵态氮（MA）、200 mg kg−1铵态氮（HA）、25 mg kg−1硝态氮（LN）、100 mg kg−1硝酸盐氮（MN）和200 mg kg−1硝酸盐氮（HN）。

研究手段

16S rDNA测序+qPCR

研究背景近年来，细菌群落结构在驱动土壤抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes, ARGs）变化中的作用越来越受到研究者的关注。由于细菌群落结构是决定土壤中ARGs含量的重要因素，任何影响细菌群落的物质，如氮的改良剂，都会影响土壤中ARGs的丰度。本研究的目的是利用qPCR和高通量测序技术研究两种氮形态（NH4+-N和NO3--N）对土壤有机质和细菌群落的影响。假设增加土壤中可溶性氮（NH4+-N和NO3--N）浓度会改变土壤细菌群落结构和携带ARGs细菌的丰度，从而改变ARGs的丰度。

样本处理

铵态氮以NH4Cl的形式施用，硝态氮以NaNO3的形式施用，这些改良剂与土壤充分混合，所有处理分三次进行。样品在25℃的光温箱中孵育，每周添加三次超纯水，以保持土壤含水量的60%。施氮后0～32天取样。在提取DNA之前，土壤样本保存在−80°C。

研究思路

分三步走的思路，土壤中ARGs的丰度——施氮土壤细菌群落结构研究——施氮土壤中ARGs与细菌群落的关系。共检测6个ARGs，分别是β-内酰胺耐药基因（blaTEM-1）、氯霉素耐药基因（cmlA）、氨基糖苷类耐药基因（str）、磺胺类耐药基因（sul1）、四环素耐药基因（tetO）和IS6转座子酶（tnpA-4）。同时测定16S rRNA基因丰度，定量估算了细菌的丰度。

主要结果

添加100-200mg kg-1 NH4+-N或NO3--N可以增加ARGs的相对丰度，但降低16S rRNA基因丰度。施氮量为100mg kg-1 NH4+-N显著降低了细菌群落的丰度和多样性，NH4+-N和NO3--N处理土壤的群落结构存在差异。Pearson相关分析和RDA土壤细菌群落与ARGs之间的相关性，NH4+-N或NO3--N的加入使土壤中ARGs丰度增加，这可能与寄主细菌群落的变化有关。这些结果表明，施用NH4+-N或NO3--N可能触发土壤细菌群落中ARGs的发生，并且可能是除了众所周知的动物粪便抗生素暴露对土壤中ARGs丰度的影响之外的另一个危险因素。

主要展示形式与说明

图1 基于qPCR的16S rRNA丰度和抗生素耐药基因（ARGs）

图2 通过16S rRNA基因测序揭示了不同处理土壤细菌群落结构

（a） 土壤中门的相对丰度。所有样品中丰度<0.1%的门被归为“次要门”

（b） 土壤中最丰富属的相对丰度热图

图3 基于Bray-Curtis距离的主坐标分析

表1  土壤中ARGs与门的Pearson相关系数（R2）。

表2  土壤中ARGs与属的Pearson相关系数（R2）。

表1不同处理土壤中ARGs与最丰富门之间的Pearson相关性分析。在本研究检测的6个ARGs中，有4个与Proteobacteria呈正相关，分别为blatem1、cmlA、sul1和tnpA-4，str与厚壁菌门呈显著负相关。为了更深入地分析细菌群落结构，表2测定了ARGs与土壤中最丰富的19个属之间的相关性。Proteobacteria门的两个菌属与ARGs显著相关。粘液球菌与5个ARGs (blatem1、cmlA、sul1、tetO、tnpA-4)呈负相关，而亚硝化螺菌与blatem1、cmlA、tnpA-4呈显著相关。氨基糖苷抗性基因(str)与丰富的属间无显著相关性。

图4 细菌群落与ARGs关系RDA分析

（a） 主要门与ARGs的关系。红色箭头表示抗性基因。蓝色的丰度最高的五个门。

（b） 丰度最高的细菌属与ARGs的关系。蓝色的代表最高的五个属。

结论

典型的高氮改良剂，包括含ARGs细菌的肥料和生物固体，可能不会直接影响土壤ARGs的发生。相反，氮本身有助于解释ARGs的这些变化。了解含有ARG的有机动物改良剂的所有成分的影响将有助于分离ARG本身的影响。因此，在得出关于改性剂对土壤ARGs负荷影响的确切结论之前，应考虑改性剂的性质。这些结果强烈表明，改良剂性质会影响土壤中ARGs的丰度和类型，因此需要进一步研究以帮助识别ARGs本身的影响。

参考文献

Silu Sun, Chao Lu, Juan Liu. Antibiotic resistance gene abundance and bacterial community structure in soils altered by Ammonium and Nitrate Concentrations. Soil Biology and Biochemistry, 2020-08-26 , DOI: 10.1016/j.soilbio.2020.107965

本文一作孙思路对你说：

本研究的主要亮点在于研究了不同的氮素对土壤中抗生素抗性基因的影响，之前研究多关注于向土壤中施用含外源ARGs的物质探究对土壤中ARGs和细菌群落的影响，本研究选择了农田常用的氮素作为研究变量，对农田施用氮素和控制ARGs污染有一定的指导意义。

本研究发表SBB经历了一次拒稿重投，一次大修，用时一年时间。第一次被拒稿时认真研究了审稿人和编辑的意见，将本文的创新性凸显出来。之后的大修根据审稿人意见将前言进行了缩减，并且将结论去掉，更加精简专注研究的结果和创新点。

发表SBB一定要强调自己研究的创新性，将自己的研究与之前的研究的不同之处和创新性强调出来。细节之处也要注意用词精准，与主题无关的内容可以删减。SBB并不鼓励作者写"Summary"或者"Conclusions"，可以在讨论的结尾写简短的一个结尾，说明接下来要做什么以给看到这篇论文的人启发。

本研究中的微生物测序是在联川开展的。联川的服务水平很高，数据分析十分准确，高通量测序结果清晰，图表也十分美观，对文章发表帮助很大。本课题组长期与联川合作微生物测序等相关项目。

相关阅读