Cell子刊综述：口腔微生物群的部位特征 | 微生物专题

口腔微生物群的部位特点：微米级生境与生态位

Oral Microbiome Geography: Micron-Scale Habitat and Niche

Cell Host & Microbe [IF: 15.923]

发表日期：2020-08-12

DOI：https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.07.009

第一作者：Jessica L. Mark Welch1

通讯作者：Jessica L. Mark Welch ([e-mail])1, Jessica L. Mark Welch ([e-mail])2

合作作者: S. Tabita Ramı´rez-Puebla

正文

口腔内存在多个微环境，相互之间通过唾液交流。口腔内不同部位，如牙齿、舌头、颊黏膜和牙龈，含有不同的形态、底物、和稳定性，这提供了不同的微生境。口腔内微生物的空间结构是由动态平衡中的各种力量（唾液流动和粘附、脱落和附着）以及微生物和宿主之间的相互作用形成的。口腔内的每个微生境都可以形成一个复杂的、独特的微生物群落。口腔微生物群落不仅影响口腔的健康和疾病，而且在全身健康中都发挥着重要作用。定植于口腔的微生物产生空间有序的生物膜。微生境地指的是外部性-允许微生物生存的物理空间和化学环境，包括微生物群落其他成员的贡献。生态位是指生物体的活动和每个成员在群落中扮演的角色。成员之间的互动以及与环境的相互作用促进菌群成为一个整体。最近的研究强调了空间组织在人类微生物生态的各个方面的重要性，本综述重点介绍口腔内的主要微生境和生态位是如何通过微米级梯度结合短程和长程相互作用。本文讨论了微米级的结构对微生物群落的作用，并提供对它们的群落生态和潜在致病性的洞察。

图1|口腔内的主要微生境

口腔内存在不同的表面形态及成分为微生物提供了不同的微生境。DNA测序样本一般通过擦除或刮取≥1cm²的面积，但是毫米级到微米级的特征变化可能会造成微生物定植的差异。HMP采样的位点以粗体标记；还显示了一些附加位点(非粗体)。
（A）龈上菌斑、龈下菌斑、角化牙龈；蓝色标记处为HMP项目的取样位点。
（B）硬腭、颊粘膜。高倍镜图像显示的是颊粘膜上的微生境。
（C）腭扁桃体、咽喉、舌背；高倍镜图像显示舌背微生境。

口腔中大约存在760种细菌，其中的几十种常见菌构成了口腔微生物的大部分，而许多细菌在健康的人类口腔中的检出率和丰度都很低。人类微生物群项目(HMP)对口腔中9种独特的栖息地进行了采样。取样的表面包括牙面、龈上菌斑和龈下菌斑；非角化上皮(颊粘膜和喉部)；角化上皮(附着牙龈和硬腭)；以及特化上皮(扁桃体和舌背)；唾液。即使在一个口腔位点内，不同的环境条件也会产生不同的微生境，从而造成微生物的差异。牙冠上的氧气很丰富，但龈沟中的牙面处于缺氧环境中，浸泡在龈沟液中，龈沟液是一种从牙龈组织中渗出的富含蛋白质的物质。舌背表面有多重乳头，增加了微生物的多样性。因此，口腔提供了一个结构复杂的环境，具有一系列不同的、迄今尚未完全探索的微生境。

口腔微生境中的位点特异性菌群

Site-specialist communities in the major oral habitats

利用DNA测序对微生物进行高通量鉴定，可以在整体水平上表征群落，并识别组成牙菌斑的微生物群落和粘膜表面的微生物群落之间的主要区别。在健康人中，龈上和龈下菌斑相似。舌背的微生物菌群与从咽喉和腭扁桃体采集的微生物菌群相似，颊黏膜、牙龈和口腔上颚(颊粘膜、角化牙龈和硬腭)的微生物菌群相似。(2)舌背的微生物菌群与从咽喉和腭扁桃体采集的微生物菌群相似，而颊黏膜、牙龈和上颚的微生物菌群(颊粘膜、角化牙龈和硬腭)相似。因此，口腔内的不同部位可以根据微生物菌群特征来区分，并大致分为三类组：牙菌斑；舌头和相关部位；以及牙龈、颊黏膜和硬腭。

另一篇权威综述提出：口腔中的每一种微生物都具有位点特异性，因此一个口腔部位的微生物菌群与其他口腔部位的微生物菌群在组成和比例上都不同。通过细菌培养的早期研究表明，大多数细菌不是广泛存在口腔中的，而是生长在口腔内某些微生境。每种微生物都有一个“初级生态位”—例如牙齿、舌头或颊粘膜。对16S rRNA基因的高通量研究支持了这一结论，表明在16S rRNA基因测序区域中相差小至单个核苷酸的密切相关分类群在口腔不同部位之间的分布也有很大的差异。对全基因组序列的分析提供了更精确的结果，区分了一个物种的菌株，密切相关的菌株和物种之间发现了高度的位点特异性。基于对这些研究，本文提出了口腔微生物菌群的位点特异性假说。

位点特异性假说对口腔微生物群落的结构和功能有重要意义。也就是说，决定微生物生态位的最重要因素是它的微生境，包括近邻的细菌。这意味着口腔内的微生物之间形成了高度特异性的细菌间相互作用，从而导致大多数细菌被限制在已有共生菌定植的某种微生境中。口腔中不同部位的微生物群落结构相似，因为它们主要由几十种丰度较高的细菌组成，这些细菌来自核心属，这些核心属在每个部位的菌群中都有代表菌。只是，在不同位点的物种是不同的。例如，放线菌属有存在于菌斑的菌种和专门存在于舌背的菌种。梭杆菌属、细毛菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、链球菌属和韦洛氏菌属也是如此。同一个菌属中不同的菌种在不同位点的差异-表明微生物群落中不同成员相互适应，并随着群落从一个口腔位点适应到另一个地点而共同进化过程。这种共同进化表明，微生物本身是彼此环境的重要组成部分，细菌之间的关系是高度特异的，一个细菌不能简单地替代来自不同口腔部位的近亲细菌。

图2|口腔内的选择性作用力

口腔微生物群是由相反因素的动态平衡形成的：流动和粘附，脱落和定植，宿主和微生物。

（A）流动和粘附。唾液流动对口腔底物的黏附有选择性，使细菌既可保留在口腔中，又可定位于良好的代谢环境。口腔基质包括牙齿表面、角化上皮和非角化上皮。
（B）脱落和定植。生物膜的机械破坏或下层底物的脱落通过新获得的底物的定植来平衡。不同口腔部位独特群落的发展是通过微生物与不同口腔基质的不同结合、残留微生物生物膜的重新生长以及生长中的生物膜被额外的分类群定殖来实现的。稳定的表面，如牙面和舌背，会形成厚厚的生物膜，而在快速脱落的表面，如颊粘膜，生物膜较薄。
（C）宿主和微生物。宿主和微生物群落通过结合作用、免疫监视以及营养和溶质的梯度作用实现相互作用。宿主分泌唾液粘蛋白，这是一种复杂的糖蛋白，支持混合微生物群落的生长，这些微生物拥有能够从粘蛋白中释放寡糖的糖苷酶。宿主将硝酸盐和其他营养物质分泌到唾液中，同时也将龈沟液从龈沟释放到口腔中，也可能有助于促进特定微生物的生长，而免疫监测则会限制其他微生物的生长。反过来，微生物新陈代谢可以产生强烈的局部氧气和营养梯度。微生物在这些梯度中有利位置的定植有利于微生物群落内的代谢相互作用和空间结构的形成。

口腔独特的菌群结构表明微生物必须适应选择性的力量，才能在口腔中生存繁殖，宿主也必须适应这些选择性力量。口腔内存在三对对应的作用因素：

流动和粘附。流动和粘附两种相反力量相互作用造成了细菌滞留(图2A)。唾液流动对口腔中的粘附提出了选择性要求：只有当微生物附着在底层底物或附着在底物上的其他微生物上时，它们才能在口腔中的持续存在。唾液流动还可以防止微生物代谢物在口腔中积聚，因此要求微生物之间必须临近才能相互作用。为应对这种选择性作用力，口腔微生物发展了高度特异的粘附素-受体相互作用，这种形成了一种被称为共粘附或共聚集的现象，这种情况下不同属的微生物之间发生结合。结合作用具有菌株特异性，在某些情况下也是位点特异性的。例如，韦氏杆菌和链球菌是口腔常见的定植菌，但来自舌部的韦氏杆菌与来自舌部的链球菌结合，而来自牙菌斑的韦氏杆菌与来自牙菌斑的链球菌结合。因此，唾液流动对粘附的细菌施加选择性压力，能够使得一些微生物的定植存留下来，也能够精确定位局部的新陈代谢环境。精确的空间定位对微生物的生存至关重要。

脱落和定植。口腔内每个部位的微生物群落进一步受到下层基质脱落(或从下层基质中剥离)和重新定植回基质的相对动态的影响(图2B)。在牙齿釉质表面上，将细菌移除的力量来源于口腔卫生措施或咀嚼食物造成的磨损。在没有磨损和口腔卫生的地方，菌斑生物膜可以持续很长时间。长时间的细菌存留使得细菌通过繁殖和黏附成为复杂的菌群。相反，在粘膜表面，上皮细胞与附着的微生物群一起有规律地脱落，并通过吞咽从口腔中去除。脱落的速率，以及定植率和性质，影响着粘膜表面菌群的密度及其成员和空间结构。基于口腔粘膜表面的表面积和唾液中上皮细胞的数量，Dawes(2003)估计口腔上皮细胞的表层每2.7小时更换一次-这个速度避免了厚生物膜的形成，而且Dawes确实报告了在腭部、牙龈和舌背的快速脱落的上皮细胞上只有单层细菌。

最近，通过轻轻刮舌背，我们不仅检测到了稀疏定植的上皮细胞，而且还检测到了更厚的生物膜，具有高度复杂的结构，这表明舌背的上皮细胞是快速脱落、稀疏定殖的细菌和寿命更长的结构的混合物，在这些结构上可以形成更大规模的生物膜。生物膜的脱落速度不仅影响生物膜的整体厚度，而且影响生物膜的空间结构。口腔生物膜可以分析为具有独特微生物组成的菌斑团块。人们可以推断，脱落的速度会影响这些斑块的大小。口腔表面的薄生物膜很可能在整个过程中都能很好地利用氧气，但随着生物膜厚度的增加，缺氧生境可能会发展，这些微生境中厌氧菌的丰度可能会增加。因此，上皮脱落的特性有助于构建口腔中微生物生物膜的组成和空间结构。

微生物脱落之后，或者因磨损而损失微生物之后，会有新的微生物的定植。口腔中干净的釉质表面立即形成获得唾液膜或基于蛋白质的覆盖物，先驱定植菌对其具有高度特异性。例如，先驱定植链球菌上的细胞表面粘附素与釉质膜中糖蛋白或粘蛋白的唾液酸内的半胱氨酸重复结构域结合。新暴露的上皮细胞迅速形成获得膜。一些先驱定植菌更容易粘附在这些粘膜表面。特定细菌对于黏膜表面的黏附可以部分地被免疫球蛋白A所调节，后者既附着于粘膜，又附着于一组口腔共生细菌。因此，微生物的定植取决于来自宿主和微生物的分子。

宿主和微生物。宿主和微生物通过持续的相互作用和适应来相互影响(图2C)。宿主的唾液冲刷和免疫反应可以减少微生物数量。然而，因为粘蛋白和营养物质，如乳酸、碳酸氢盐、硝酸盐和维生素被主动分泌到唾液中，因此唾液也是选择微生物定植的重要影响因素。唾液粘蛋白促进能从这些宿主底物中释放寡糖的微生物的生长，并且能够促进它们的共生菌生长。因此，粘蛋白的复杂性可以促进结构化微生物群落的生长，并阻止某单种细菌的过度生长。口腔细菌之间的协同作用涉及食物网，在食物网中，一种细菌产生一种废物，如乳酸，作为其他乳酸消费细菌的重要营养。当细胞非常贴近时，这种代谢合作就会发生。因此口腔环境会形成共聚集和空间共存的菌群。宿主分泌乳酸，也可能分泌碳酸氢盐，可以选择性地促进参与这些食物网的细菌的生长，并成为宿主影响微生物菌群空间结构的一种机制。

宿主将硝酸盐分泌到唾液中可以促进兼性厌氧菌的生长，它们利用硝酸盐作为呼吸电子受体；微生物将硝酸盐转化为亚硝酸盐，进而生成一氧化氮。饮食中的硝酸盐有助于维持一氧化氮稳态。一氧化氮有益于宿主健康，包括降低血压、改善内皮功能、逆转代谢综合征和减少氧化应激。口腔微生物区系的其他潜在有益功能包括通过物理阻断上皮和分泌抗菌素来限制非共生微生物进入宿主上皮。因此，宿主和微生物菌群之间的相互作用是一种动态平衡，双方都从中受益，并且各自调节对方的新陈代谢。

图3|口腔微生物组中微米级相关关系的多样性

（A)一些微生物具有高度特异性的结构组合。牙菌斑中的玉米芯状结构是链球菌(绿色)或卟啉单胞菌(蓝色)对棒状杆菌属(品红色)的特异性结合，即使在其他丝状菌存在的情况下，如具核梭杆菌(黄色)、纤毛菌(青色)和噬二氧化碳纤维菌属(红色)也可在同一区域结合。圆圈表示棒状杆菌细丝周围形成的玉米芯结构。
（B）一些微生物类群易于形成簇状。这里显示在舌背上的五个分类群以斑块的形式出现，这些斑块具有不同的特征形状和与寄主上皮细胞的关系，但与其他4个细菌簇中都表现出明显的克隆边界。例如，罗氏菌(青色)与放线菌(红色)、奈瑟菌科(黄色)、韦龙氏菌(洋红)和链球菌(绿色)相邻。

对浓度梯度在空间结构微生物群落中的重要性的认识可以追溯到19世纪80年代和19世纪90年代的 Winogradsky 。这些概念是由Wimpenny阐述的，他指出了在空间组织的生态系统中扩散在溶质运输中的重要性，并得出结论，使用溶质的有机体应该尽可能接近其来源。紧密的细胞间联系和浓度梯度对于形成每种微生物的微生境都很重要。正如电子显微镜和共聚焦显微镜所看到的那样，在牙菌斑中明显存在密切的细胞间联系。这些方法表明，牙菌斑是一种紧密堆积的微生物生物膜，它被分为不同微生物组成的层。分层的形态本身暗示着浓度梯度的存在。然而，随后的口腔生物膜的微探针分析和荧光成像分别为氧化还原电位和pH的微米级梯度提供了直接证据。

通过使用组合标记和光谱成像FISH(CLASI-FISH)来检测微生物，使我们认识到牙菌斑不只是层状结构的。菌群结构类似刺猬，在这种群落中，需氧菌和兼性厌氧菌覆盖着大约20至30毫米宽的外壳。在这个外部好氧的外壳内有一个中间层，由在微好氧条件下生长良好的细菌占据；棒状杆菌属(Coryneillus spp.)。在它的底部密密麻麻地堆积着，并通过中间层延伸到外壳。
同样，在Wibert等人描述的舌背生物膜中。需氧菌或兼性厌氧菌倾向于占据外层，结构的深层核心富含厌氧生长的细菌。口腔生物膜中微生物的分布，以及这些细菌的生长要求，表明观察到的层化现象证明了微生境具有不同的氧气和其他小分子的条件，推测是由微生物本身产生的，因此产生的梯度足够大，足以在几微米到几十微米宽的条带中产生不同的微生物组成。

除了生境带和梯度之外，不同细菌之间紧密的细胞间联系是口腔生物膜的特征，也是细菌之间分子水平粘附相互作用的微米级表现。不同细菌的混合可以通过电子显微镜观察到。通过以种或属水平的细菌为目标的探针，可以通过FISH实现鉴别和鉴定。对牙菌斑形成早期阶段进行的FISH实验显示，不同分类群的成员之间有密切的接触，这表明共粘附对于形成可在不同细菌之间发生代谢相互作用的多属微菌落非常重要。最近的一项研究使共粘附和空间组织之间的联系变得明确，证明了从单个个体分离的菌株中存在广泛的共聚作用，并表明参与大量共聚的菌株存在于小集群中或分散在整个未受干扰的生物膜中。因此，无论是空间组织还是分子相互作用都表明细菌-细菌相互作用在口腔生物膜中将微生物定位微生境的重要性。

与疾病相关的生物膜的不同区域存在明显的微生物组成差异。在重度牙周炎中，龈下生物膜的特征是兼性或专性的厌氧分类群，如放线菌、梭杆菌和密螺旋体，以及似乎在原有生物膜上定居并在其中形成微菌落的牙周病原体。相比之下，龈上生物膜具有不同和更多的异质结构和成分。类似地，在患龋牙齿中，不同的生境具有不同的微生物组成，龋损中以及邻近龋损的生物膜外层均存在乳杆菌和双歧杆菌等致病分类群，而放线菌(Actinomyces spp.)。在牙釉质中沿着裂缝的入口处发现了许多细菌。Kim等人证明了空间组织和生物膜致病性之间的直接联系。研究龋齿中的变形链球菌。它们表明，早期的生物膜薄而平，以变形链球菌和非致病性口腔链球菌混合为特征，而后来的生物膜形成了两个分类群相互分离的穹顶结构。变形链球菌产生葡聚糖是分离所必需的，也是形成与釉质脱矿有关的穹顶结构所必需的。

口腔中生物膜的异质性表明，要了解口腔生物膜的动态和功能，需要了解细菌之间的相互作用。口腔生物膜中细菌的空间排列以及它们背后的分子相互作用都表明，许多细菌在一个位点具有一系列潜在的共生菌。在体外的共聚集相互作用中，相同的受体可以被多个不同细菌的粘附素识别，然后这些粘附素竞争结合；一些细胞可以与多种细菌的相互作用，有些细菌只能与少数细菌产生相互作用。

在体外口腔生物膜的图像中也观察到了相互作用的一系列特异性。牙菌斑中称为玉米芯的结构具有高度定型的排列，中心细丝被单层或双层球菌包围(图3A)。参与的球菌不是非特异性的；它们属于链球菌、卟啉单胞菌和嗜血杆菌/聚集菌属。在天然的健康菌斑中，这些玉米芯选择性地围绕棒状杆菌形成。当假丝酵母开花时，会产生一种不同但表面上相似的玉米芯状排列。因此，玉米芯是一个典型的细菌-细菌间相互作用的例子，但在成员关系上有一定的灵活性。具有特色的舌背复合体不仅形状和大小更加多变，而且排列也更加灵活。舌部菌群是由一组以斑块和条纹排列的细菌组成的。S.mitis**、S.silvarius和Veillonella spp.这几种细菌之间具有明显的聚集性，常常在菌斑中同时出现(图3B和3C)。同样，在牙菌斑生物膜中，每个细菌都可以在各种最近邻关系中找到。这些复杂多变的结构表明，大多数口腔微生物能够在从特定生境某些协同共生细菌旁边生长。

Fusobacterium nucleatum被认为在口腔生物膜的结构中占有特殊的地位。它能够与包括早期和晚期定植者在内的多种细菌共聚集；它进入生物膜的时间处于早期和晚期定植者之间的中间阶段，它的出现似乎与晚期定植的厌氧菌进入生物膜有关。因此，Kolenbrand等人提出了提出“具核梭杆菌是斑块的中心结构成分，对菌斑成熟和增加斑块多样性是必不可少的。”

我们认为，目前可用的资料并不能充分证明，Fusobacterium nucleatum是早期和晚期定植牙菌斑生物之间的物理桥梁。相反，我们假设Fusobacterium nucleatum是一种机会主义的定植者，是菌斑成熟到缺氧生态位可用的程度的指示器。在牙菌斑刺猬结构中，棒状杆菌属(Coryneillus spp.)。形成结构桥，从结构的底部延伸到尖端，在那里它们形成了玉米芯结构的核心，这些玉米芯结构的边缘环绕着刺猬。梭杆菌属(Fusobacterium spp.)。梭杆菌属(Fusobacterium spp.)应该是以团块或零星的细丝形式存在，而不是作为物理桥梁而存在，并且Leptotrichia spp.和Capnocytophaga spp.应该占据了与Fusobacterium spp.相似的生态位。Zijine发现Fusobacterium spp在龈上菌斑中的作用并不突出，而在龈下菌斑中是重要的组成。在龈上生物膜中，Dge等人观察到Fusobacterium spp散布在菌斑外层的表面之下是专性厌氧菌。
它们最重要的要求可能是低氧浓度。F.nucleatum能够与各种细菌聚集在一起，这表明它可以通过附着在多种细菌表面来构建低氧浓度微环境。

短程因素和长程因素相互作用

Short-range and long-range factors interact

虽然直接粘附和强微米级梯度等短程因素对微米级微生境有很强的影响，但长程因素与这些短程因素相互作用，可能以复杂的方式影响口腔生物膜的组成。相互作用可能发生在跨越口腔许多厘米的微生物之间，通过小分子在空气中扩散，或通过唾液运输。细菌团块及其分泌的产物可能会影响牙菌斑的生物学或其他粘膜部位的菌群。

在最近发表的两篇综述中，Proctor及其同事提出，由于唾液从一个地方到另一个地方的组成和流动速度的不同，可能会导致群落组成的局部变化。唾液流速的变化会导致生物膜表面物质清除率的变化，这可能会增强或减弱生物膜内的微米级梯度。在生物膜中有通道的情况下，流速的影响也会直接影响生物膜中更深的位置。

如果采样是以空间精度进行的，就可以通过排序方法在一个地点内以毫米为尺度定义不同的栖息地。Simo‘n-Soro等人在112个地点分别对2个人进行了抽样，发现前庭(口腔)地点的链球菌含量非常高，犬类的韦洛氏菌含量最高。Proctor等人对30个人的口腔和舌部进行了采样，发现最丰富的细菌是一致的，但不太丰富的分类群从嘴的前面到嘴的后面显示出丰度的梯度，特别是在舌部。虽然这两项研究都发现了不同牙齿或牙齿不同方面上牙菌斑微生物菌群比例发生变化的证据。这可能是因为研究之间取样方法、样本数量、和菌群空间结构的差异造成的。所以牙菌斑群落如何在口腔中移动的问题没有产生一个统一的答案。正如Simo‘n-Soro等人指出的那样，从单个牙齿的单个方面取样会导致收集的菌斑样本不具有代表性。正如Proctor等人指出的那样，使结果的解释变得复杂的是，任何这样的地点的群落不仅可能受到确定性因素的影响，还可能受到漂移的影响。影响群落组成细节的关键因素，包括局部的表面结构等因素，可能会产生局部显著的影响。此外，采样方法，如拭子、纸尖或刮拭器，可能会意外地从唾液或邻近的牙龈组织以及预期的目标菌斑中收集微生物，唾液中的微生物或从邻近的非菌斑部位移出的微生物可能会并入菌斑生物膜。简而言之，DNA测序方法现在可以非常准确和完整地告诉我们在我们收集并均质的样本中存在哪些微生物，但用于测序的采样技术缺乏必要的空间分辨率来研究群落结构。为了解决微生物是如何组织的，它们如何相互作用，以及每种微生物在采样地点的口腔生物膜生理中的功能作用等问题，我们需要更高水平的空间分辨率的分析方法，并且空间组织尽可能保持完整。

结论 Conclusion

本综述集中在口腔微生物群的微米级的微生境和生态位上。虽然多种成像已经揭示了丰富的生态相互作用，但要解开空间模式在口腔微生物生态学中的作用，还需要克服技术障碍找到新的方法。通过原位杂交鉴定微生物需要固定样本，不能展现它的变化情况。有必要设计一种方法来进行活菌成像，以捕捉微生物群落组装和运转的动态。从机理上理解将需要体外实验，这些实验允许对单个成分进行干扰和分析。生长在口腔表面的细菌受到了不同的表面形态、局部梯度以及与多种不同微生物物种的相互作用。信息丰富的体外实验将需要工程化的微环境来捕捉这些复杂的特性。绘制口腔微生物群地理图的意义可能在于，一方面为未来口腔微生物生态学的空间研究提供了路线图，另一方面为如何合理设计微生物群落以促进口腔和全身健康提供了基线。

参考文献

Jessica L. Mark Welch, S. Tabita Ramírez-Puebla & Gary G. Borisy. (2020). Oral Microbiome Geography: Micron-Scale Habitat and Niche. Cell Host & Microbe 28, 160-168, doi: https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.07.009

相关阅读