DNA背景介绍及常规样本采集 | 核酸提取专题

前三节我们了解到了前两节内容，核酸惊心动魄的百年史、RNA背景知识全解、近万字长文概述RNA常规样本采集事项 | 核酸提取专题，今天来看看DNA背景介绍及常规样本采集。

DNA提取是分子生物学实验技术中重要、基本的操作之一，那怎么正确、高效的采集到我们所需的样本呢？今天小编就为大家带来植物、动物、细胞、全血/外周血、口腔拭子/唾液、浆膜积液的采集方法。

1.  DNA背景介绍及提取原则

图1.1 DNA结构

DNA是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学实验技术中重要、基本的操作之一。

一般真核细胞基因组DNA有10⁷-10⁹bp，DNA与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色丝，染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。

从组织中提取DNA，根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。

基因组DNA提取的原则：

1）保证核酸一级结构的完整性（因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础）。

2）排除其它分子（如蛋白质、多糖、脂类、有机溶剂等）的污染，使下游实验顺利进行。

3）核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度的金属离子。

4）提取得到的DNA片段需从分子质量、浓度、纯度等方面进行检测，从而判断DNA质量，只有符合质量要求的DNA才可以继续进行后续生物学实验。

5）影响DNA提取质量的主要因素包括材料来源、取材方法、储存温度、提取方法等。

接下来我们就从这几个方面来解析一下如何获得高质量的DNA用于下游实验。

2.  常规样本采集

2.1. 样本采集前注意事项

2.2.1高危样品寄送声明

对于危害程度为第一、二类的高致病性样品，只接收提取后的核酸样品，不接收组织、血液、菌体等样品。对于危害程度为三、四类的致病性或传染性的样品（组织、血液、菌体等），必须先通过销售或公司技术人员沟通，确认无高致病和传染性且能进行后续实验后再安排样品寄送。危害程度的判定标准具体参见《人间传染的病原微生物名录》。

样品应采用WHO提出的三级包装系统，第一层容器：装样品，要求防渗漏；第二层要求耐受性好、防渗漏，容纳并保护第一层容器；第三层容器：放在一个运输用外层包装内。在第二层包装注明“致病性样品接收时请注意”字样，尽量同时附上病原菌拉丁文，并在信息单注明其危害程度及接收注意事项。

如果未提前告知样本中病原菌信息，联川有权销毁或返还样本。

2.1.2.样本准备基本原则

1）本指南中的方法和建议绝大部分适用于以DNA为检测对象的测序项目。

2）由于样本采集方法不是唯一的，本指南提供为一般性方法。如您使用的方法已被证明有效或是您希望参照所研究领域的文献方法，您可以使用已被证明有效的方法进行取样。

3）特别注意，样本寄送过多或过少都不利于实验正常开展，请参照指南要求的量提供样本。

4）如样本需同时进行其他检测，请参照相关项目的要求采集和保存样本。不同检测项目的样本需分开保存于独立的样本保存管中。

5）采样过程应尽量避免对样本的干扰，缩短保存和运输时间。

6）样本采集后，请尽快将样本置于-80℃保存或液氮速冻保存，或马上进行样本DNA抽提，避免样本储存不当影响实验结果。

7）联川不接收含病原微生物的人源样本（如传染病人的肠道来源样本），或是含有可传人病原微生物的哺乳动物来源的样本，或是无法判断是否有危害的样本。但可以接收病原微生物或上述样本提取的DNA样本，或是已做灭活处理的致病菌样本。

8）整个样本采集过程，都须遵守无菌操作。

2.2. 植物组织采集

1）选取新鲜、幼嫩、生长旺盛的组织部位，植物组织越幼嫩越新鲜所含的次生代谢产物越少，随着植物的逐渐成熟，所含的次生代谢产物越来越多，而次生代谢产物会影响DNA的抽提；

2）（部分植物样本可选做）迅速用预冷的Nuclease-Free水配制的1×PBS或生理盐水清洗组织表面的污渍，吸干表面的液体（一定要吸干表面液体），用剪刀剪切成长宽为0.5cm的大小（若非特殊情况，长度最好不要超过10cm）；

3）处理好的组织迅速放入预冷好的已写好编号的Nuclease-Free的耐-192℃超低温的螺纹冻存管中，液氮速冻>1h，转移到-80℃长期保存，在DNA提取前避免反复冻融，干冰寄送样本。如只做DNA类实验，没有条件的情况下可以不做液氮速冻，直接-80℃冻存。

2.3.  动物组织采集

2.3.1.采集方法

1）医生采集术后30min内的新鲜组织或穿刺组织，去除非研究的组织类型（如结缔组织，脂肪组织等），如果是医学病变组织的取材要正确判断病变及正常组织，应将病变组织周围的正常组织去掉，反之亦然；

2）组织样本取总量≥60mg（豌豆大小），穿刺组织长度至少1cm，取2-3条；

3）迅速用2-6℃预冷Nuclease-Free水配制的1×PBS或生理盐水清洗组织表面的污渍，无菌滤纸吸干表面的液体；

4）处理好的组织迅速放入预冷好的已写好编号的Nuclease-Free的耐-192℃超低温的螺纹冻存管中，液氮速冻＞1h，转移到-80℃长期保存，在DNA提取前避免反复冻融，干冰寄送样本如只做DNA类实验，没有条件的情况下可以不做液氮速冻，直接-80℃冻存。

冻存管

1.5mL离心管

1.5mL螺旋盖离心管

图2.1 冻存管图示

2.3.2.注意事项

1)如果实验室没有条件，如缺乏液氮、干冰以及-80℃冰箱等条件下，需要DNA Locker及类似组织保存液保存的样本，严格按照操作说明进行，组织块需切成长、宽、高为0.5cm的小块，组织块过大会影响DNA Locker渗透入组织内部的效率，也会造成DNA Locker无法完全覆盖组织，而未被DNA Locker覆盖的组织部位极易被核酸酶降解。

2)不允许寄送用裂解液保存的组织样本，用Trizol等裂解液保存的组织样本不能提出合格的DNA。动物及临床组织不要使用锡箔纸包裹，锡箔纸容易与动物及医学组织粘在一起，DNA抽提的过程锡箔纸容易带入，引起污染，且锡箔纸上的字体容易模糊导致无法辨别。

2.4. 细胞样本采集

2.4.1.贴壁细胞的处理

1)从培养箱取出贴壁生长的细胞，显微镜下观察细胞确定生长状态良好，小心去除培养基；

2)加入Nuclease-Free水配制的1×PBS后，平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去PBS，洗2次以彻底洗去培养基；

3)将培养皿置于冰上，向培养皿内加入4℃预冷的1×PBS，用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），冰上斜置培养皿，使得缓冲液流向一侧，移液管吸取液体到2-6℃预冷的离心管内，200-1,000g，4℃离心5-10min去上清；

4)沉淀转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管中，液氮速冻＞1h后，转移至-80℃冰箱长期保存或干冰寄送样本。如只做DNA实验，没有条件的情况下可以不做液氮速冻，直接-80℃冻存。

2.4.2. 悬浮细胞的处理

1)选取生长状态良好的细胞悬液；

2)200-1,000g，4℃离心5-10min，弃上清培养基得到细胞沉淀；

3) 加入3mL Nuclease-Free水配制的1×PBS后（如无大体积离心机，可采用小体积如1.5ml，多次清洗），移液器吹打悬起细胞沉淀，然后用200g，4℃离心5min，弃PBS，重复清洗一次；

4)得到的沉淀转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管中，液氮速冻＞1h，转移至-80℃长期保存或干冰寄送样本通过干冰运输寄出。如只做DNA实验，没有条件的情况下可以不做液氮速冻，直接-80℃冻存。

2.5. 全血/外周血采集

2.5.1.全血样本

•  三种采血管介绍

EDTA抗凝管（对照全血）

PAXgene管（液态活检相关外周血）

Streck管（液态活检相关外周血）

图2.2 采血管

1)EDTA抗凝管：美国BD公司的EDTA抗凝真空采血管（紫色瓶盖），乙二胺四乙酸（EDTA，分子量292）及其盐是一种氨基多羧基酸，对血细胞全面周到的保护，尤其对血小板的保护作用，有效阻止血小板聚集，并保护血细胞的形态和体积在较长的时内不受影响。48h内送达可冰袋运输，需保证冰袋数量，运输过程避免剧烈晃动，防止溶血，超过48h需干冰运输。

2)PAXgene管：QIAGEN公司的PAXgene Blood cfDNA Tube管，又名静脉真空采血管，PAXgene全血15-25℃常温运输，需7天内送达，35℃时需24h内送达。

3)Streck管：美国Streck公司的Streck Cell-Free DNA BCT采血管，含有K3EDTA抗凝血剂和一种液态的细胞防腐剂，Streck全血6-28℃常温运输，需7天内送达。

• 采血步骤：

紫色EDTA采血管：

1)样本采集前，先用碘酒，碘伏等皮肤消毒剂由内向四周对采血部位进行消毒；

2)采血至特定的采血管中，数量达到负压允许的最大值；

3)样本采集完成后，立即轻柔颠倒混匀10次，动作尽可能平缓，防止剧烈混匀导致溶血；

4)混匀完毕后，正立放置于室温下1h后，48h内送达可冰袋运输，需保证冰袋数量，运输过程避免剧烈晃动，防止溶血，超过48h需干冰运输；

5)或直接转入耐-192℃低温的螺纹口冻存管中，液氮速冻1h后（注意不可直接速冻采血管，防止采血管低温下爆裂），转入-80℃冰箱保存，干冰运输。如只做DNA类实验，没有条件的情况下可以不做液氮速冻，直接-80冻存。

Streck采血管：

1)样本采集前先用碘酒，碘伏等皮肤消毒剂由内向四周对采血部位进行消毒；

2)采血至特定采血管中，数量达到负压允许的最大值；

3)样本采集完成，立即轻柔颠倒混匀10次，动作尽可能平缓，防止剧烈混匀导致溶血；

4)混匀完毕后，正立放置于室温下保存，不可冻融，全血6-28℃常温运输，需7天内送达。

图2.3 紫色EDTA抗凝管采血流程

2.5.2.血液中PBMC分离方法

图2.4

图2.5 PBMC图示

建议使用紫色EDTA抗凝管收集全血样本，实验开始前将Ficoll和PBS从低温恢复到室温。

1) 将采血管上下轻轻颠倒混匀10次后，立即将全血置于4°C或冰盒中正立放置；

2)1,200g，室温离心10min分离得到上层血浆样本（全血需在1h内进行血浆分离，依据抗凝管操作说明或客户实验室血浆分离步骤进行操作）；

3)向50mL离心管（标记A）中加入10mL Ficoll，随后最好静置一段时间；向另一只50mL离心管（标记B）加入10mL PBS；

4)稀释：温和摇匀抗凝采血管，用kimwipes或者消毒纱布移除上盖并放一边，将10mL血液转移至B离心管，温和混合，获得PBS混合液（20mL）；

5)适度倾斜离心管A，将20mL PBS混合液沿壁缓慢加入（注意要缓慢，过快会穿破Ficoll层，极大影响提取效果）；

6)梯度离心：小心地将离心管放入离心机（不要扰动液体层），700g，室温离心20min，加速/减速分别设置为9/1；

7)离心之后小心将其取出，放置于操作台上，可见分为四层，见图2.5；

8)可选：先移除淋巴细胞层上2-3mm的血浆，方便后面吸取；

9)用P1000移液枪尽可能吸取PBMC，转移至15mL离心管，尽量避免吸取血浆和Ficoll；

10)加入PBS使体积变为10mL，盖上盖并温和翻转摇匀5次；

11)300g，室温离心10min，去上清并轻弹离心管末端，直至细胞团在剩余PBS中完全重悬；

12)得到的浑浊液转移至耐-192℃低温的螺纹口冻存管，液氮速冻1h后，-80℃长期保存或通过干冰寄送。

2.5.3.    医学血液样本采集

• 注意事项：

1)血浆输血3天后，可进行肿瘤基因检测；

2)输血4周后，可进行肿瘤基因检测；

3)静脉化疗/放疗结束10天后，可进行肿瘤基因检测；

4)医院专业采血人员根据检测项目的要求，可选择EDTA抗凝管（严禁使用肝素抗凝管）、PAXgene管或Streck管，收集10mL全血，然后将该样本的样品信息单装入自封袋，与样本一起寄送。

• 血液采集方法参见全血采集

常见采血问题及解决方案供参考

表1.1 常见采血问题及解决方案

2.6. 口腔拭子/唾液采集

2.6.1. 口腔拭子采集

1)取样前1h不要进食、吸烟、饮水、饮酒或嚼口香糖等；

2)准备一杯清水，充分洗漱口腔约10s后吐掉，以清除口内的食物残渣等；

3)将拭子伸进左侧口腔，使拭子头部充分接触左侧脸颊上下牙床粘膜处，用刷牙的力度上下擦动，同时旋转拭子，让拭子头部充分接触口腔粘膜；

4)用同样的方法在右侧脸颊内部/右侧上下牙床处粘膜处进行第2根拭子的采集；

5)左右口腔拭子各一根，采集完成后装回采集管中，管壁上写明样本编号，24-48h内常温寄送。

• 注意事项：

受检者可以按照标准采集流程说明书，使用联川提供的植绒性口腔拭子（推荐济凡生物口腔拭子样本DNA采集套装FS206、或苏州泰通口腔拭子）进行样本采集，然后将该样本的提交单装入自封袋，与样本一起常温运输。为预防样品提取出现问题，建议同时多寄送一份做备用。

苏州泰通口腔拭子

济凡生物口腔拭子

图2.6 推荐口腔拭子

2.6.2.口腔唾液采集

1)取样前1h，不要进食、饮水、饮酒、吸烟或嚼口香糖，建议晨起取样；

2)受试者需要至少在口腔中分泌收集唾液1min。打开无菌唾液采集器，采集唾液（推荐济凡生物唾液DNA样本采集管FS107）。此过程需要重复多次采集到2-5mL唾液（不含泡沫部分）。管壁上写明样本编号，然后将该样本的提交单装入自封袋，与样本一起常温运输。

图2.8 推荐唾液采集器

2.7. 浆膜腔积液采集

浆膜腔是浆膜脏层和壁层之间的密闭间隙。在正常情况下，浆膜腔内有少量液体起润滑作用，由壁层浆膜产生，脏膜回收。病理情况下，浆膜腔内液体增多，称为浆膜腔积液。浆膜腔积液是以浆膜腔内液体产生为特征的病理过程，其最常见病因有急、慢性炎症、心功能不全、原发或转移性肿瘤等，浆膜腔积液检验可反映不同的诱因和不同的医学严重程度（Antony V B,2005,11(4):296）。按部位分为胸腔积液、腹腔积液、心包积液、关节腔积液。

建议由医院专业人员采集至指定管中，写明样本编号，然后将该样本的提交单装入自封袋，与样本一起干冰或常温运输。

2.7.1.浆膜腔积液采集方法

1)方法一：抽取10-20mL新鲜胸腹水或心包积液于Streck全管，严格按照Streck全管使用注意事项进行操作，采集完毕后上下温和混匀10次；6-28℃运输，72h内送达，需另附2-5mL EDTA全血作为对照样本；

2)方法二：取10-20mL新鲜胸腹水或积液于无菌离心管中，5,000rpm，室温离心3min，去上清，将所得沉淀细胞转入1.5mL离心管中，封口膜封口，干冰运输。

关于DNA常规样本采集，在我们的核酸提取手册中还有石蜡样本采集、环境微生物采集、植物内/外生菌采集、动物外生菌采集、肠道内容物采集、培养菌体的采集等系列内容，对其中内容感兴趣的老师可扫描下方二维码进行购买。

相关阅读