口腔微生物生态位特化与鼻咽癌风险有关 | 微生物专题

摘要

口腔健康和口腔微生物群的变化与局部或系统癌症有关。口腔卫生不良是鼻咽癌(NPC)的已知危险因素，鼻咽癌是中国南方流行的一种与病毒相关的头颈部癌症。本文通过16S rRNA基因测序技术，对南方某地区499例鼻咽癌患者和495例年龄、性别匹配的对照进行了研究，探讨了鼻咽癌与口腔微生物群的关系。结果表明与对照组相比，疾病组的物种丰富度显著降低。鼻咽癌患者和健康对照的口腔微生物群存在差异，这可能与密切相关的共生体中微生物多样性的丧失和生态位的特化有关。

发表期刊：mSystems

发表时间：2020

影响因子：6.519

研究内容：16SrRNA测序技术研究微生物多样性

对象与方法

在2010年至2014年间从中国南方梧州地区招募足够受试者，利用16S rRNA基因的V3-4高变区对口腔微生物群进行表征；将成对的末端序列去噪为扩增子序列变体(ASV)。在测序和去噪之后，有1066个对象样本具有足够高质量的序列和元数据来保留用于分析。初步调查表明，少数吸烟者的微生物群具有高度的异质性，因此被排除在最终分析之外，最终保留了994个样本（499例鼻咽癌患者和495例对照组）。

结果展示

微生物群的分类特征

来自994个个体的ASV表包括来自20纲，66科，125属的5824个ASV。从表面上看，这些群落与之前报道的中国成年人口腔微生物区系相似。最丰富的属是Streptococcus链球菌(芽孢杆菌类；平均相对丰度28.1%；IQ（25%-75%的四分位间区），17.4%-36.1%)，Neisseria奈瑟氏菌(β变形杆菌类，平均19.3%；IQ，9.7%-27.7%)。Prevotella普氏菌(杆菌类，平均为12.1%；IQ为6.0%-16.9%)、Veillonella韦龙氏菌(梭状芽孢杆菌类，平均为8.8%；IQ为4.0%-11.7%)和Haemophilus嗜血杆菌(革马氏杆菌类，平均为5.5%；IQ为2.8%-7.4%)。

为了研究鼻咽癌和口腔微生物群之间关系，对潜在的混杂因素进行收集。主要混杂因素包括口腔卫生和健康、吸烟、鼻咽癌家族史、饮茶、口咽炎病史，个体居住的区域、酒精摄入、咸鱼食用等被视为鼻咽癌的危险因素。

多样性分析

通过比较疾病组和对照组之间的α多样性，发现鼻咽癌组与对照组相比，总体ASV显著减少，系统发育多样性降低，香农多样性降低(秩和检验P<0.001)(图1a)；调整与α多样性显着相关的协变量后，这些发现没有改变(图1b)。因此，这表明新诊断的鼻咽癌患者的总体微生物多样性低于健康对照。与其他身体部位不同，唾液微生物群落的丰富性和微生物群落的健康之间没有明确的关系。

类似地，当通过针对性别、年龄和测序量进行最小调整的Adonis模型比较Beta多样性时，基于未加权的UniFrac、加权的UniFrac和Bray-Curtis距离，发现了鼻咽癌患者和对照组之间存在显著差异（图1c、d）。与相同背景下的潜在混杂因素相比，NPC状态是未加权UniFrac距离的最强解释因素，是次强变量影响大小的五倍多，也是紧随吸烟之后的加权UniFrac和Bray-Curtis距离的次强因素。在任何指标上，病例和对照之间的离散度在统计学上没有显著差异，支持这种差异是由于病例和对照之间一致的差异（图1d）。

这些发现表明，NPC状态和吸烟与人口腔微生物群的差异密切相关；在有机体的存在和不存在方面，NPC的相关性特别强(如未加权的unifrac距离所强调的那样)，但就丰度而言，仅次于吸烟(如加权的unifrac距离和bray-curtis距离所揭示的)。

由于微生物群与NPC状态之间的关系在未加权的UniFrac距离中最强，因此使用完全调整的对数二项模型评估ASV患病率和疾病之间的关系，该模型调整了年龄、性别、测序、吸烟状况、社区和缺失或修复牙齿的数量，对ASV患病率和疾病之间的关系进行了完全调整的对数二项模型。为了限制虚假相关性，将存在定义为相对丰度大于0.02%，并将重点放在至少10%的样本(n=245)中存在的ASV。最终确定了53个ASV，它们在疾病组和对照组之间有显著差异(FDR P<0.05)(图1E)。这些ASV中的绝大多数在对照组中更为普遍，来自广泛的分类学分支，这可能表明鼻咽癌患者ASV在某种程度上是随机丢失的，而不是特定生物体的系统性丢失。这一发现与α多样性研究结果一致，可能表明整个群落不稳定。相反，有两种ASV在病例中更为常见：一种是Lactobacillus乳杆菌属(Lact-eca9)的成员，另一种是Granulicatella颗粒链菌ASV(Gran-7770)。

图 1鼻咽癌患者的口腔菌群与健康对照组差异性

NPC状态与微生物群落关系

为了评估NPC状态是否影响基于丰度的微生物群落划分，应用Phylofactor构建模型寻找区分鼻咽癌病例和对照的系统发育分支，调整潜在的混杂因素（图2）。在检查的12个因素中，有9个与疾病状况有关。数据中的初步划分表明，鼻咽癌患者中的Granulicatella ASV(GRAN-7770)比对照组丰富3.4倍(95%可信区间[CI]，2.4-4.9倍)。第三个因素确定了第二种Granulicatella ASV(Gran-5a37)在病例中的丰度较低。这两种ASV也与吸烟状况有关。同时发现了三个与NPC状态相关的微生物丰度的大规模变化：对照组的变形杆菌门和拟杆菌门的相对丰度较高，NPC状态与拟杆菌科、普氏菌科的一部分的比例增加有关。

图 2 分类群的系统发育划分与鼻咽癌(NPC)状态有显著的相关性

使用一种改进的多变量的微生物群组成分析(ANCOM)对基于Phylofactor的丰度分析进行补充。发现6个ASV的归一化ANCOM W至少为0.8，这意味着在至少80%的比较中，ASV与社区中其他ASV相比有显著变化。所有已鉴定的ASV在疾病组中都更为丰富。包括Granulicatella ASV(Gran-7770)，它被Phylofactor鉴定为群落中最重要的特征；两种Streptococcus(Strep-b566和Strep-c0f8)；Lactobacillus ASV(Lact-eca9)，它被确定在疾病组中更普遍；一个未指明的Gemellaceae(Geme-8a62)，以及一种来自Abiotrophia的ASV(Abio-2673)等。

基于Granulicatella ASV的丰度和覆盖率在病例和对照之间的显著差异，对该属进行进一步的研究。两个Granulicatella adiacens和Granulicatella elegans，是口腔微生物群中普遍存在的成员，并在多种口腔环境中被检测到，尽管G. elegans经常定殖于颊粘膜和角化牙龈，而G. adiacens定殖于舌头，但都占据着更广泛的生态位。

在本研究中，每个人都至少携带了一些Granulicatella；平均来说，该属占相对丰度的3.4%（图3a）。个体携带的属的相对丰度与疾病状态之间没有关系。通过多项Logistic回归分析来确认疾病状况与个体携带的变种显著相关：与单独携带Gran-5a37的几率相比，疾病组同时携带两种ASV的几率显著更高，此外单独携带Gran-7770的几率显著更高(图3b)。尽管吸烟者更有可能同时患有ASV或单独患有Gran-7770，但吸烟和疾病状况之间没有显著的相互作用。

图 3 Granulicatella adiacens变种对群落结构的预测

微生物群落的相关性分析

基于SparCC的网络分析来确定Granulicatella可能与之相互作用的其他群落成员，从而对微生物群产生影响。共识别出五个网络（图4a）。这个主要网络由两个簇组成，共20种微生物，它们与一种Granulicatella变种呈正相关；网络的主要成员属于韦龙氏菌、链球菌和普氏菌。通过HOMD的BLAST搜索，鉴定了另外两对ASV，它们在两个节点之间共排除，但被映射到相同的克隆型：stre-900d和stre-0531(副血链球菌分支411)和产黑色普雷沃菌(prev-b7f2和prev-71e7)（图4b）。

图 4 Granulicatella adiacens变种位于密切相关的共生生物体网络的中心

总结

鼻咽癌患者和健康对照者之间的口腔微生物群落存在差异，这是其他测量因素无法解释的。这种差异既与群落丰富度的丧失有关，也与特定生物之间的差异有关，包括来自Granulicatella的密切相关的ASV。此外，确定了一个包括这些Granulicatella变种的共发生和共排除ASV的网络。这些结果有力地揭示了新诊断患者的口腔微生物群与鼻咽癌状态之间的关系。

编者说

本文通过16SrDNA测序分析揭示了与鼻咽癌相关的口腔微生物群，同时对于关键物种的变化进行了探讨说明，利用相关性分析揭示出了微生物群落之间的共发生网络关系，最终展示出了疾病与对照组之间微生物群落的差异关系，整体基本展示出了16S分析的常规内容，值得微生物研究者学习。

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