10分+文章带你揭开TP53-微生物-肺癌之间的关系 | 肿瘤微生物
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。已有大量资料表明，长期大量吸烟以及基因突变与肺癌的发生有非常密切的关系。也有一些研究证实，肿瘤内微生物与肿瘤的发生发展有关。由此，是否能假设基因突变与香烟烟雾一起会诱使肺癌组织菌群失调，而这与肺癌发生相关。以下研究通过对健康肺和肺肿瘤组织进行微生物组研究，对上述假设进行了验证。
文章内容：肺癌组织中微生物群与TP53的相互作用
发表杂志：Genome Biology
杂志分区：生物1区
影响因子：14.028
发表时间：2018.08
主要技术手段：16S rRNA基因测序、FISH、16S全长测序（Pacbio）
检测样本：33例对照和143例癌症患者的肺组织
为了研究肺癌组织样本中微生物群落是否发生了变化，作者首先比较了尸检肺组织样本（IA）、良性肺结节的患者的肺组织活检样本（HB）、NCI-MD的肺癌旁组织和肿瘤组织（Non-Tumor和Tumor)的16S rRNA基因测序数据中5个比较重要的门水平物种的丰度在各组之间的差异情况。从图1a中可以看到，在门水平物种中，与IA组相比，HB组、NCI-MD的Non-Tumor组和Tumor组变形菌门丰度显著增加（Kruskal–Wallis，p= 0.0002），而厚壁菌丰度显著降低（Kruskal–Wallis，p= 0.04），与Tumor组相比，IA和HB的梭杆菌属门丰度更高。此外，在TCGA的Non-Tumor组和Tumor组中，变形菌门也有相应的增加。
其次，通过对IA、HB和NCI-MD的Non-Tumor组和Tumor组的chao1指数和Simpson指数进行了分析，发现与IA相比，Non-Tumor组和Tumor组的丰度度更高，与HB相比，Non-Tumor组和Tumor组的用来衡量丰富度和均匀度的Simpson更高，这表明肺癌组织的微生物多样性从未患病状态发生了改变。
最后，作者通过对beta多样性（bray-curtis）分析得知，不管是IA、HB和NCI-MD的Non-Tumor组和Tumor组4组之间（PERMANOVA F=2.9 0 ,p= 0.001）还有Non-Tumor组和Tumor组两组之间(PERMANOVA F=2.94, p= 0.001)的beta多样性存在显著不同，同时，腺癌（AD)组和鳞癌（SCC）组的beta多样性也存在显著差异(PERMANOVA F=2.27 ,p= 0.005)，见图1c-e。此外，TCGA的Non-Tumor组和Tumor组两组之间(PERMANOVA F=3 . 6 3 , p= 0.001)以及腺癌（AD)组和鳞状细胞癌（SCC）组(PERMANOVA F=2 7.19 , p= 0.001)的beta多样性也存在显著不同。
综上，这些数据说明了与肺癌相关的菌群多样性和丰富性呈增加的趋势。
图1 非病变和癌组织中肺微生物组的细菌分布和多样性
鳞状细胞癌（SCC）和腺癌（AD）是两种最常见的非小细胞肺癌，它们分别集中支气管内的细胞和外周气道。在前期的研究报道中表明COPD（慢性阻塞性肺病）患者的支气管和下肺的微生物群落不同。鉴于本研究中与AD肿瘤相比，来自上肺的支气管肿瘤和SCC肿瘤的菌属丰度更高且AD肿瘤的分类学分布与COPD的分类学丰度也更相似。所以，后续分析将患病位置作为一种混杂因素。
在对NCI-MD样本的研究中，作者确定了32个在SCC肿瘤(n= 47) 和AD肿瘤 (n=67) 中具有显著性差异的属(Student’s t-test; MWP < 0.05)，且其中有9个物种经FDR校验后仍具有显著性差异，分别有Acidovorax, Brevundimonas, Comamonas, Tepidimonas, Rhodoferax, Klebsiella, Leptothrix, Polaromonas, Anaerococcus（见图2a)，同样的结果也在TCGA的样本中得到了验证(AD=485，SCC=489)(Mann-Whitney FDR校正p值<0.05)(见图2b）。
图2 能区分吸烟状况和肺癌亚型的微生物类群
图2a和图2b分别展示NCI-MD和TCGA样本群中按照组织亚型分类和吸烟状况分类的属水平差异物种丰度情况，其中标记 为*的物种为NCI-MD和TCGA中共有的物种
为了控制像年龄、性别、解剖位置和吸烟状况等混杂因素，作者在NCI-MD的研究中进行了逻辑回归分析，发现与AD肿瘤相比，这些属中有九分之六的物种与SCC肿瘤的发生有关（见图2c），在对TCGA样本的研究中，发现有九分之四的属水平物种 (Acidovorax, Klebsiella, Rhodoferax, Anaerococcus) 与SCC肿瘤的发生有关（见图2d）(FDR corrected P< 0.05)。综合以上结果，在对NCI-MD和TCGA两个不同的样本群进行研究时，均表明与AD肿瘤相比，一些特定的物种在SCC有显著富集，这完全可以区分吸烟患者中的AD肿瘤和SCC肿瘤。
AD肿瘤和SCC肿瘤都与吸烟相关，而SCC与吸烟的相关性更强。为了研究是否SCC中有特定的微生物群落与吸烟相关，在对NCI-MD样本的研究中，作者通过线性判别分析LEfSe对SCC肿瘤中曾经吸烟(Ever, n=40)、从不吸烟(Never, n=7)和经常吸烟者(Current,n=70）的分析寻找SCC肿瘤与吸烟的biomarker。从中发现了6个物种可以作为SCC肿瘤中从不吸烟患者和曾经吸烟患者的biomarker(见图3）。
图3 LEfSe分析
不管是在NCI-MD样本，还是在TCGA样本的研究中都发现，与Never组患者相比，Ever组患者和Current组患者的Acidovorax 丰度更高(见图4a)。但是并未发现Acidovorax 的丰度与戒烟时间有关。此外，还发现，在Ever组患者和Current组患者中，与AD肿瘤患者相比，SCC肿瘤患者的Acidovorax和Klebsiella的相对丰度更高（见图4b）,说明两个物种不仅在吸烟的肿瘤患者中丰度更高，而且在吸烟的SCC肿瘤患者中丰度也更高。
图4 Acidovorax的相对丰度按吸烟状况和组织学亚型分层
作者进一步使用FISH 技术证明了这个物种在肿瘤中是存在的，且用Pacbio测序鉴定到这个物种是A. temperans（见图4c, d)。
SCC肿瘤中最常见的体细胞突变是TP53基因。大约75%-80%的SCC肿瘤患者都发生了TP53基因突变，为了验证是否TP53基因突变的SCC肿瘤患者中与SCC肿瘤相关的菌群的丰度更高，作者使用TP53特异性测序(MiSeq)或TCGA公布的TP53突变分析数据，研究NCI-MD(n=107)和TCGA(n=409)数据集中TP53突变与菌群之间的相关性。
图5 TP53突变与鳞状细胞肺肿瘤特异性的菌群丰度相关
在不考虑组织学的情况下，通过对NCI-MD数据集的分析发现在一类菌群在发生了TP53基因突变的肿瘤中更为丰富（见图5a)。这一结果也在TCGA数据集中得到了验证（见图5b)。在单独对SCC肿瘤样本进行分析时，这种情况就更突出了，尤其是那些在前面研究中与SCC肿瘤相关的菌群。其中在NCI-MD的中，在SCC和AD具有显著差异的属中有5个（Acidovorax， Klebsiella， Rhodoferax， Comamonas， Polarmonas）在发生了TP53基因突变的肿瘤中也更加丰富（见图5c）。同时，在TCGA中，与SCC相关的5个属的丰度也在发生了TP53基因突变的SCC肿瘤中差异倍数更高（MW corrected FDR < 0.01）（见图5d）。而以上这种情况并未在AD肿瘤中出现，说明在SCC肿瘤中具有高度代表性的几个物种与TP53基因的突变相关。
为实现对肺癌病人的个体化诊疗，近年来NGS技术成为肺癌研究领域中的重要技术手段。高通量测序技术具有通量更高、运行时间更短、花费更少等优点。应用高通量测序技术从微生物的角度揭示肺癌发生发展机制，寻找新的生物标志物为临床诊断和治疗提供证据也是为人类战胜肺癌又打开了一扇窗户。
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参考文献
Greathouse KL, White JR, Vargas AJ, et al. Interaction between the microbiome and TP53 in human lung cancer. Genome Biol. 2018 Aug 24;19(1):123. doi: 10.1186/s13059-018-1501-6. Erratum in: Genome Biol. 2020 Feb 20;21(1):41.
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