用户文章Plant J：m6A修饰影响拟南芥耐盐性状 | m6A专题

论文标题：N⁶‐methyladenosine mRNA methylation is important for salt stress tolerance in Arabidopsis

刊登日期：2021年4月

发表杂志：Plant Journal

影响因子：6.141

研究机构：江苏师范大学

开展项目：m6A测序

1. 盐胁迫导致拟南芥整体m6A水平增加且相关基因失调目前已在多种植物中证实，盐胁迫、干旱胁迫等会引起植物体内几百个基因的m6A修饰水平出现变化。作者随机构建了拟南芥常见几种m6A甲基化酶如MTA、MTB、VIR、FIP37和hakai的突变体用于研究拟南芥耐盐分子机制。值得注意的是，m6A水平根据m6A writers表达水平的降低而不同程度降低，MTB-RNAi、Vir-1和hakai突变体和敲除的样本中m6A水平显著降低，但在ABI3:MTA敲低后m6A水平下降不高。作者推测可能是拟南芥苗龄期不同造成的。在盐胁迫下，Vir-1、MTB-RNAi和hakai幼苗的生长受到强烈抑制，而ABI3:MTA幼苗的生长受到较少抑制。这些结果表明m6A修饰会影响植物盐胁迫的应激反应。在盐胁迫下，vir-1突变体的幼苗和根系生长受到强烈抑制，并且rescue补救实验结果也反向验证了这个结果。综上所述，这些结果表明vir介导的m6A甲基化修饰在拟南芥适应盐胁迫中起着重要作用。
2. 盐胁迫和正常条件下m6A修饰主要富集在Vir的3’UTR区域作者对vir-1突变体和control进行了m6A测序。在正常和盐胁迫条件下，与野生型WT相比，vir-1突变体中m6A的总体富集度显著降低。且m6A的peak基本上富集在3’UTR区域和转录终止位点附近。为了进一步验证m6A测序数据，随机选择10个带m6A修饰的基因进行m6A-IP-qPCR验证（万字长文教你做m6A-IP-qPCR至尊豪华版 | m6A专题）。结果表明在盐胁迫下，在vir-1突变体的3ʹUTR和最后一个外显子中观察到m6A修饰程度显著减少。Motif分析显示，无论是经典的RRACH还是植物特有的UGUAH，都显著富集。GO功能富集分析表明，m6A修饰的基因主要参与包括对盐胁迫、冷胁迫或脱落酸相关功能。盐胁迫处理后WT拟南芥中约23%的基因m6A水平升高，而约37%的基因m6A水平降低。值得注意的是，与WT中的5ʹUTR和3ʹUTR相比，外显子中的m6A富集程度显著降低。总之这些结果表明，在正常和盐胁迫条件下，VIR对m6A修饰富集起关键作用，且主要集中在3ʹUTRs区域。
3. 盐胁迫下整体m6A水平降低与基因表达差异相关对WT和vir-1突变体在正常和盐胁迫两种条件处理下的拟南芥样本进行转录组测序。与WT相比，在正常条件下检测到vir-1突变体中的整体基因表达显著增加，并且在盐胁迫下突变体中的几个基因的表达略有增加或减少。转录组与m6A联合分析表明，正常条件下vir-1突变体中基因m6A修饰水平显著增加。盐胁迫诱导了细胞凋亡相关的基因m6A水平出现下调，却增加了WT的整体基因表达。值得注意的是，在正常条件下，m6A水平增加或减少的基因在vir-1突变体中的表达总体上有所增加，而在盐胁迫下，这些基因的表达在突变体中增加或减少。重要的是，在盐胁迫下WT中3ʹUTR中的m6A peak在vir-1突变体中出现降低或消失，并且在突变体中含有m6A的基因的表达降低。这些结果表明，m6A修饰对植物的整体基因表达有不同的影响。
4. m6A修饰抑制ATAF1、EGR1、GI和GSTU17的表达作者首先分析了vir介导的m6A修饰相关mRNAs表达的整体变化，发现在盐胁迫条件下出现254个上调基因和522个下调基因。GO富集分析表明，上调的基因包括与伤害应激反应、干旱和ABA反应有关的基因，而下调的基因主要与盐胁迫反应、转录调节和光合作用有关，暗示了一种可能与病毒侵染后引起m6A修饰变化应激反应的相关机制。作者对VIR-1突变体中一些盐胁迫离子调节因子相关基因如SOS1、SOS2、SOS3、RD22和HKT1进行了RT-qPCR验证后发现，这些基因并未出现非常显著变化。作者推测拟南芥对盐胁迫应激相关基因可能与阳离子调节因子失调无关。随后作者对一些负调节基因，包括NAC转录因子（ATAF1）、clade E生长调节型2C蛋白磷酸酶1（EGR1）、GIGANTEA（GI）和谷胱甘肽S-转移酶U17（GSTU17）进行了验证。结果表明与WT相比，vir-1突变体中这些负调节基因表达都显著增加，并且在盐胁迫处理后这些基因表达进一步升高。与m6A测序数据进行关联分析后发现，这些盐胁迫相关的负调节基因的m6A修饰水平在vir-1突变体以及盐胁迫处理后显著下降且富集在3’UTR区域，且通过m6A-IP-qPCR验证（万字长文教你做m6A-IP-qPCR至尊豪华版 | m6A专题）。这些结果证实VIR影响mRNA上3’UTR区域m6A修饰，并且对ATAF1、EGR1、GI和GSTU17的mRNA水平的表达有负调控作用。
5. m6A修饰介导3’UTR长度从而影响ATAF1、GI和GSTU17衰变已有的一些的研究表明，3’UTR带有m6A修饰会影响mRNA稳定性（YTHDF3促进带有m6A修饰的RNA的翻译和降解 | m6A专题 ；Nature：YTHDF2介导mRNA降解导致子代斑马鱼发育迟缓 | m6A专题（7） ）。利用放线菌素D对ATAF1、GI、GSTU17和EGR1进行mRNA稳定性测试后发现，在正常条件下与WT相比，vir-1突变体中ATAF1、GI、GSTU17和EGR1转录物的衰变略微延迟，而在盐胁迫下突变体中，这些转录物的衰变显著延迟。相比之下，其他盐胁迫敏感基因如SOS3、HKT1和SAD1以及不含m6A修饰的微管蛋白基因的衰变率，在WT和vir-1突变体之间具有可比性。总之，这些发现表明ATAF1、GI、GSTU17和EGR1的3ʹUTR中m6A修饰的缺失稳定了转录物并有助于转录物水平的增强。转录组和m6A数据进行联合分析的时候作者发现，在正常和盐胁迫条件下的vir-1突变体中，当基因的3’UTR上不携带m6A修饰时，这些基因的3ʹUTR长度出现大量改变。通过RT-PCR分析了这些转录物中3ʹUTR的长度，其中有几个反向引物与每个基因中潜在m6A位点下游的不同位置互补。结果表明，在vir-1突变体中检测到与含有不同长度的3ʹUTR的基因相对应的条带，而在WT中类似的条带缺失或相对较弱，这表明vir能够介导的m6A修饰降低并显著延长了基因3’UTR的长度。鉴于3ʹUTR长度的调节通常与选择性切割和多聚腺苷化（也叫alternative cleavage and polyadenylation, APA）相关。APA可产生具有不同长度3' UTR的mRNA异构体，还可以改变基因的编码区。在过去的十几年的研究中，APA在细胞增殖、分化、肿瘤的发生等过程中扮演重要的角色。不同组织中mRNA异构体 3' UTR的长度具有显著性差异，例如神经组织中mRNA异构体倾向于具有较长的3'UTR，而卵巢、睾丸、骨骼、肌肉等组织中mRNA异构体具有相对较短的3' UTR。作者接下来研究了ATAF1、GI、GSTU17和EGR1的3ʹUTR长度的变化是否是由polyA的替代A碱基使用（alternative poly(A) site usage）引起的。  通过RACE全长扩增，确定了ATAF1、GI、GSTU17和EGR1转录本的3ʹ末端，并在ATAF1、GI和GSTU17转录本中发现两个polyA位点，在EGR1转录本中发现一个polyA位点。接下来，通过qRT-PCR测定WT和vir-1突变体中含有不同3ʹUTR长度的转录本水平，并计算含有近端polyA位点（称为PA1）和远端polyA位点（称为PA2）的转录本水平的比率。结果表明在正常条件下，与WT和互补系相比，vir-1突变体的ATAF1转录物的PA2/PA1比值略有增加，而GI和GSTU17转录物的PA2/PA1比值在vir-1突变体中略有增加。盐胁迫处理后，这种情况会进一步加剧！总之，m6A甲基化的缺失通过APA促进ATAF1、GI和GSTU17的3ʹUTR显著延长。
6. ATAF1、GSTU17和GI的高表达与vir-1突变体通过活性氧的过度积累引起的盐敏感性有关ATAF1参与盐胁迫下活性氧（ROS）的形成，GSTU17参与调节谷胱甘肽水平，影响活性氧清除，GI通过抑制盐胁迫下SOS2功能影响ROS水平。作者假设这些由VIR介导的m6A修饰缺失引起的盐反应负调节因子的上调可能会影响ROS内稳态，最终导致VIR-1突变体的盐敏感性。在盐胁迫下，vir-1突变体中的ROS水平显著高于WT和vir-1杂交品系中的ROS水平。重要的是，NAC是一种有效的活性氧清除剂，可显著提高盐胁迫下vir-1突变体的种子萌发、幼苗生长和存活率。这些结果支持一种假设：ROS的过度积累是vir-1突变体盐敏感性的重要因素之一。为了在盐胁迫下建立ATAF1、GSTU17或GI上调与vir-1突变体ROS水平升高之间的牢固联系，使用amiR和测量的ROS水平瞬时抑制这些基因在vir-1突变体原生质体中的表达。完整的原生质体在转染24小时后被清楚地观察到，其中每个基因的mRNA水平通过qRT PCR被证实显著降低。在amiR-ATAF1、amiR-GSTU17和amiR-GI株系中，添加100 mM NaCl的24小时后每组原生质体中的ROS水平显著降低，但在amiR-EGR1株系中没有降低，这表明ATAF1、GSTU17和GI的上调是导致vir-1突变体中ROS水平升高的原因。总之，这些结果表明m6A甲基化与盐胁迫下拟南芥ROS稳态有关。相关阅读

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