m6A修饰在造血干细胞发育时阻止了内源双链DNA的形成并启动对机体有害的固有免疫 | m6A专题

铛铛铛，亲爱的胖友们，吃饭了没？要是吃了，那来篇文献消消食？（当然你也可能只是被老板逼迫最近要做文献汇报）。大拇指是不是打枪打累了，那就看篇文献散散心，休息休息？（当然也有可能只是数据不理想，想从文献中找点新思路）。Anyway，小编还是积点口德，万一老板发现我在这边抖机灵扣我工资呢？咳咳咳，接下来开始讲正事了！today给大家带来了一篇来自cell immunity的paper解读。废话不多说，让我们开始在知识的海洋里遨游吧！

哦！指错方向了！

今天文献的题目“是m6A修饰在造血干细胞发育时阻止了内源双链DNA的形成并启动对机体有害的固有免疫” 作者是来自耶鲁大学Stephanie Halene课题组的Yiming Gao。Halene老师的前期研究表明m6A修饰能通过降低胚胎干细胞内多能性相关基因的稳定性，以此来促进细胞的分化。而敲除m6A写入器蛋白Mettl3则增强了干细胞的多能性。因此作者就想啊！敲除m6A写入器蛋白Mettl3是否也同样能在维持造血干细胞的多能性上发挥重要作用。

啥？内容和当红炸子鸡m6A相关？这一看就是大课题啊。做的好，分分钟CNS啊！因此作者赶紧通过Cre-FloxP技术构建了一批肝源Mettl3缺陷型（Mettl3-/-）的造血干细胞（图A）。并在构建好后通过q-PCR（图B）验证Mettl3的敲除效果和通过ELISA技术（图C）测定Mettl3敲除对细胞内m6A的水平的影响。从实验结果可以看到，敲除型造血干细胞具有较低的Mettl3表达水平和较低的m6A修饰水平，这些内容说明，模型构建地非常perfect。因此，万事具备只欠后续的实验开展了！

所有实验都要由浅入深，因此作者第一步，看Mettl3敲除后细胞表型的变化：

1. Mettl3的敲除抑制了造血干细胞的增殖。从图A可以看到Mettl3敲除显著下调了肝源细胞（造血干细胞的来源）的数量，并抑制了造血干细胞的群落形成的能力（图B）；而通过流式细胞术的结果可以看出，Mettl3的敲除并不影响造血干细胞的细胞存活率（图C和D），但却造成了细胞周期的G1期阻滞（图E和F）。那这些结果说明Mettl3通过改变细胞周期对造血干细胞细胞增殖的影响。

2. Mettl3的敲除还造成造血干细胞功能的障碍。主要表现为降低了造血干细胞内各种功能细胞的群落形成单位（CFU，图A和B），而从单细胞数据也可以得出，各种功能细胞的细胞数量也有一定程度的下调趋势（图C），流式细胞术进一步表明，Mettl3的敲除上调了造血干细胞数（LSK细胞，Lin-Sca-1-c-Kit-，图D,E,F和G）并降低LSK细胞中多能分化干细胞的数量（该细胞具有分化潜能，Flt3+CD34+，图H和I）。而当通过质粒过表达Mettl3后，下调的功能细胞集落群有一定程度的恢复，则从侧面证明Mettl3的缺失是造成造血干细胞分化功能异常的原因（图J）。

好了，以上数据，小编不负责任地毛估估了下哦，发个5分文章应该不成问题。But，everybody pay attention！这是一篇immunity啊！光表型数据是远远不够的，肯定还要再加点具体的分子机制！

因此，作者接着探究Mettl3敲除对基因层面的变化。作者通过流式分选取LSK细胞，从m6A-seq结合RNA-seq可以看出mettl3敲除上调了701个基因和下调1396个基因（图A和B)。并且上调基因的m6A水平较下调的更高(图C）。作者进一步做了H3K4me3沉淀后的ChIP-Seq，从图C和图D可以看出，被Mettl3敲除上调H3K4me3结合上调和在上调的基因中有697个基因与组蛋白的结合率出现了上调。

到这里，小编有点晕，这测序到底说明了什么？

因此作者通过Cytoscape做了一个通路的富集分析，结果发现在被Mettl3敲除所上调的基因中其中有很大一部分属于免疫基因和抗病毒相关基因。 

其中最为明显的Oas家族基因（图A），但是这个家族基因很有个性，他m6A修饰水平低于被Mettl3敲除上调的基因的整体水平（B），基因的组蛋白修饰水平却明显高于整体水平（C）。既然Oas家族基因如此与众不同，那么要么就是这个家族在通路中扮演重要角色，要么就纯粹是。。。。。。这个基因家族有个性罢了。

瞎猜是没用的，还是要用实验去验证的，毕竟图不是躺着睡出来的。

Oas家族作为dsRNA的sensor，能在dsRNA水平上升时上调细胞内的表达水平，因此作者检测LSK细胞内dsRNA的含量，从confocal基因中可以看出，J2（dsRNA的特异性抗体）染色强度在Mettl3敲除组中有了明显的上调，并且RIP结果也可以看出，Mettl3敲除后J2富集出的RNA明显高于正常组（C和D），而且这些基因的甲基化水平、平均长度和折叠能量也有相对程度的不同。

OK！现在，我们已知的数据有免疫反应、分化抑制和上调的双链RNA含量，那这中间的黑洞总不能不管吧？

此外，dsRNA还能激活OAS、RIG-I和PKR信号通路，那Mettl3敲除介导的dsRNA含量上调是否也能导致下游的通路的激活呢？作者通过qPCR，WB等实验得到的结果是yes! Absolutely yes!

好了，那这三个通路如何和下游联系呢？RIG-I的激活可以导致MAVS的上调并诱导干扰素的表达和免疫反应。那这里就不负责任的有根有据的假设下：Mettl3敲除是导致造血干细胞分化障碍的原因！有了假设，就用实验数据去证明他！通过crspr-cas-9将Mavs sgRNA导入细胞造血干细胞来敲除Mavs。结果发现，分化障碍有了一定的缓解，那就说明Mettl3敲除诱导的内源性免疫导致了分化受阻！这下，这个黑洞就被拔得一干二净！

下面是一个总结，小编不想码字了，自己看吧！

行文到了最后，大家有什么感悟呢？小编的感悟还是蛮深的，这第一点嘛！这篇文章思路清晰，实验数据翔实，是一篇值得仔细推敲和研究的好paper；这第二嘛，文章里用到的方法真是高大上，集结了RNA-Seq、m6A-Seq、single cell-Seq和ChIP-Seq等，一个个都是最新高分文章常用的方法。但是吧，你说说，这么多方法找找也是蛮麻烦的，如果是小编还在做实验的时候肯定是不高兴做了，毕竟要做多组学分析，我一定不相信有一家公司实力如此的强，直到我来到了联川，作为拥有14年丰富经验的多组学的公司，我们能帮你一站式的解决了你科研中遇到的所有问题，帮你答疑解惑，并且售后小哥哥小姐姐还能陪聊人生理想心痒了吗，心动了吗？还不快私信我们！

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