文献解读：儿童天然粘膜屏障和COVID-19

作者：CarlA.Pierce，KevanC.Herold，BetsyC.Herold

2019年的疫情虽然已经过去1年多了，但仿佛就在昨天。面对疫情，我国人民齐心协力、众志成城，这股强大的力量支撑着我们度过了难关。在这场疾病面前，中年人和老人成了重点保护对象，患病的人群集中在年龄偏大的群体，相反，儿童患病的几率更小，是什么原因导致的这个现象呢？下面，让我们走进这篇文章，一起来探究原因！

流行病学研究一直表明，感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的儿童的临床病程较轻，发病率和死亡率明显低于成人。疾病控制中心(CDC)估计，住院总人数的1.2-3.3%中有不到0.21%的儿童死于2019年冠状病毒疾病(COVID-19)。他们提出了几个假设来解释为什么儿童受到COVID-19的保护，不受更严重的结果的影响，包括血管紧张素转换酶2(ACE2)的表达差异，病毒进入的受体导致病毒载量降低，普通冷冠状病毒抗体的存在，可能提供部分保护，以及在感染过程早期更强有力的先天反应，以减轻强烈的适应性反应。

然而，最近的研究表明，ACE2的表达在儿童中没有减少，在成人中可能实际上较低。对感染COVID-19的儿童的调查发现，在鼻咽(NP)拭子中检测到的SARS-CoV-2RNA的数量至少与成人相同。与其他病毒交叉反应的抗体也不太可能解释临床差异，因为我们以前发现，与其他常见的冷人冠状病毒(229E，NL63，HKU1)的抗体水平在成人和儿童中相似。此外，虽然常见的感冒冠状病毒抗体水平可能会在SARS-CoV-2感染的反应中提高，但它们没有提供保护。在先前对COVID-19住院患者的分析中，我们发现在疾病过程中早期收集的血清IL-17A和IFN水平在儿童和成人中较高，并且与年龄显著且负相关。

这些发现表明，其他细胞，如先天免疫细胞内呼吸道，可能是IL-17A和IFN-的来源，更强烈的粘膜先天反应可以解释儿童较温和的临床过程。为了验证与年龄相关的结果反映病毒暴露部位宿主反应差异的假设，我们收集了来自儿科和成人患者的鼻咽(NP)拭子，这些患者向纽约州布朗克斯蒙特菲奥雷医疗中心急诊科提交，分析了收获的细胞的基因表达，并测量了粘膜中细胞因子和抗体的水平。

由于未知COVID-19在儿童中比成人更良性的原因，我们假设，对SARS-CoV-2的早期先天免疫反应更有力，可以防止严重疾病。采用大规模RNA测序和定量逆转录PCR技术，对12例儿童和27例成人鼻咽拭子中SARS-CoV-2病毒拷贝数和细胞基因表达进行比较。测定鼻液中总蛋白、细胞因子和抗SARS-CoV-2IgG和IgA。

结果显示，SARS-CoV-2拷贝数、ACE2和TMPRSS2基因在儿童和成人中表达相似，但儿童表现出与干扰素信号转导、NLRP3炎症小体和其他先天途径相关的基因表达较高。儿童比成人鼻液中检测到较高水平的FN- a2，IFN-g，IP-10，IL-8和IL-1b蛋白。儿童也表达了更高水平的与免疫细胞相关的基因，而与上皮细胞相关的基因在儿童和成人中的表达没有差异。在两组鼻液中检测到类似水平的抗SARS-CoV-2IgA和IgG。没有一个儿童需要补充氧气，而7个成年人需要补充氧气(p=0.03)，4个成年人死亡。与成人相比，这些发现提供了儿童早期粘膜免疫反应更强烈的直接证据，并提示这有助于良好的临床结果。

上证据

结果一:急诊科就诊患者分为出现COVID-19症状提示的9/12名儿科（发烧和咳嗽)和25/27名成人(发烧、咳嗽或呼吸困难），症状出现前的天数在两组之间没有显著差异（图A）。儿科和成人患者相比,NP拭子中SARS-CoV-2病毒RNA(按周期阈值[CT]值量化)水平相似（图A）。然而，结果确不相同。成人更有可能被送进医院，有较高的C反应蛋白和D-二聚体，如果住院，住院时间较长。没有一个儿科患者需要氧气，而7个成年人需要氧气，4个需要机械通气。四个成年人死亡，但没有一个儿科病人死亡。为了评估与年龄相关的结果差异是否反映了病毒暴露部位、鼻粘膜的宿主反应的差异，我们对在提交急诊科时从NP拭子中分离出来的细胞进行了RNASeq(n=6名儿科患者和15名成人患者)。管家基因RPLP0在儿科和成人样本中的表达相似。在儿科样本中，ACE2的表达呈上升趋势，TMPRSS2表达无显著性差异（图B）。我们鉴定了538个差异表达基因(P<0.05后FDR矫正)，儿童和成人患者相比，其中267个上调，271个下调（图C）。RNAseq数据集的主成分分析(PCA)将儿科和成人患者分离成不重叠的簇，第一维捕获总方差的18.4%，第二维捕获12.9%，第三维捕获7.9%（图D）。在根据呼吸支持的要求对成人进行二分法后，PCA分析表明，从不需要补充氧气的成年人是需要补充氧气的成年人和儿童之间的中间者。鉴于天然免疫基因在PCA中的表达有很强的贡献，我们进行了基因集富集分析（图E）。该基因集被富集于干扰素刺激基因和其他天然免疫应答基因，如IL1B、CCL3、CXCL10和NLRP3。结果二：

这表明在IFN-γ反应，IFN-α反应，IL-1反应，NLRP3炎症体和IL-17的产生中，儿童相对于成人患者更丰富。相反，与儿科患者相比，成人脂肪酸代谢更丰富（图B），成人与儿童的氧化磷酸化和糖酵解途径也增加，但在FDR校正后，这些途径没有统计学差异。这些发现进一步支持了儿童对SARS-CoV-2感染的先天反应。

我们使用从额外的4名儿科和5名成人患者的NP拭子中分离出来的RNA进行RT-qPCR。儿童IL-17A基因表达显著增加（图C），IFN反应基因水平较高的趋势相似（图A）。我们还测量了细胞因子NP液中的水平，发现IFN-γ,IFN-α,IL-1β,IL-8和儿科患者IP10(图D-H)与RNAseq数据一致。儿童和成人患者相比，IL-17A蛋白水平也呈上升趋势，但测量值<10pg/ml，接近检测下限。

结果三：

鼻粘膜分泌物中SARS-CoV-2特异性IgA可能有助于保护，并且我们的RNASeq数据显示， PCA基因组中有一组B细胞相关基因 (Dim2；IGHA1、IGKC、IGHM、IGHG1、FAM30A和PAX5)在成人和儿科样本中均有较高的表达。

因此，我们用ELISA和SARS-CoV-2特异性IgA和IgG检测了总IgA和IgG，分别以S1、S2为靶点，并通过多重检测法测定了穗核衣壳蛋白(NC)的受体结合结构域(RBD) NP流体。我们没有发现儿童和成人患者总IgG或IgA的差异(图A-图D)。虽然COVID-19患者的SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白水平高于健康对照组(n=7成年人)，但年龄组之间没有显着性差异。仅使用RNAseq分析中的B细胞相关基因进行聚集层次聚类，将队列分成“低”或“高”表达组。所有需要补充氧气(SO)的更严重临床疾病的成人患者均在低转录组(图E)。

结果四：

相关矩阵的生成，来探讨NP拭子运输介质中总蛋白浓度（用纳米滴测量）、抗体水平、细胞因子水平和SARS-CoV-2CT值之间的关联。一般来说，总蛋白与抗体相关，但与细胞因子无关，除了IL-18外，抗体和细胞因子之间没有强烈的相关性。IL-18与抗S RS-CoV-2IgG和IgA相关（图A）。在成人中，IL-18水平较低不需要补充氧(p=0.12)，但儿童和成人相比，IL-18水平无显着性差异。由于基因表达模式可以反映细胞组成的差异，我们还在探索性分析中比较了代表不同细胞群 体 的 标 记 的 表 达 。在 儿 童 中 ， 代 表 免 疫 细 胞 的 基 因 表 达 的 读 取 计 数 一 般 较 高：MS4A1(CD20)(p=0.004)以及CD4(p=0.046)、CD8a(p=0.036)、CD86(p=0.054)，而与上皮细胞相关的上皮细胞(包括KRT18）和ITGA6（整合素α6）在儿童和成人中没有差异(图B)。

总之，我们首次显示，与COVID-19临床表现的成人相比，儿童鼻咽早期免疫反应和先天免疫途径激活更有力的直接证据。对其他病原体的固有反应也随着年龄的增长而减少，这些保护性细胞因子的细胞来源尚不清楚，但可能包括粘膜和气道上皮细胞、不变的自然杀伤T细胞或其他免疫细胞。无论来源如何，我们的发现表明气道驻留细胞可能建立对病毒的反应,最终决定临床结果。对SARS-CoV-2早期免疫反应的年龄相关差异的原因需要进一步研究，但增强这些途径的治疗可能是一种有效的治疗策略，并有助于保护患者免受严重的结果......
是不是还没有看过瘾？

扫码看原文啦~

相关阅读

点击下方图片进入云平台资料汇总：

所见即所得，figure有bi格

联川云平台，让科研更自由