文献解读：干细胞衍生性外泌体通过抑制肿瘤抑制因子Rb1调控的NLRP3炎症因子通路修复缺血性肌肉损伤

题目：干细胞衍生性外泌体通过抑制肿瘤抑制因子Rb1调控的NLRP3炎症因子通路修复缺血性肌肉损伤。

出自：信号传导与靶向治疗杂志

影响因子：13.493

背景介绍BACKGROUND

目前尚无有效的治疗急性下肢缺血的临床方法。在组织缺血损伤之后会激活NLRP3炎性体，进而释放IL-1β、IL-18等大量炎症因子，从而富集更多的趋化因子和炎症细胞，加剧组织损伤。但激活NLRP3炎性小体的调控机制在很大程度上目前尚不明确。

Rb1蛋白是一种肿瘤抑制蛋白，失活会促进骨骼肌细胞的增殖，但是Rb1在缺血性肌肉损伤的作用仍然未知。

因此，作者通过研究Rb1和NLRP3这两种基因之间的关系来探索炎症反应的调控机制，以期为下肢缺血的临床治疗带来新的策略。

方法 METHODS

作者通过追踪Rb1基因缺失与NLRP3、IL-1β、IL-18在缺血与正常肌肉组织（n=3）中的mRNA水平和蛋白水平的变化关系，以及STRING、circBank等数据库来研究Rb1调控NLRP3炎症因子通路的机制。

结果 RESULTS

3.1 RNA测序

RNA测序（RNA-seq）结果显示，Rb1、NLRP3炎症体、IL-1β和IL-18的mRNA水平与对照组相比显著增加（a，b），并且通过qRT-PCR得到了证实（c），在蛋白水平上通过Westernblot和Elisa得到了证实（d，e）。 

然后作者对这些上调的基因进行GO富集分析，发现缺血肌肉中与炎症反应途径和NLRP3炎性体相关的生物学过程。

那么如何研究Rb1与NLRP3信号通路的关系呢？作者的思路是，将Rb1基因敲除，如果Rb1的缺失会导致NLRP3、IL-1β、IL-18的变化，那么不就可以说明Rb1是NLRP3的上游调控基因了吗？

3.2 Rb1基因敲除实验

3.2.1 肌肉特异性Rb1敲除小鼠（Rb1-mKO）模型构建

与对照组相比，Rb1-mKO小鼠的恢复能力更强（a,b），后肢握力、耐力、骨骼肌与体重的比值明显提升（c,d,e），因此，Rb1的缺失会促进骨骼肌的恢复。

并且，在mRNA水平上，NLRP3、Caspase-1（一种与细胞凋亡相关的基因）表达低于对照组，IL-1β、IL-18 血浆水平低于对照组小鼠（a，b）。

因此，我们可以推测，Rb1的缺失可能会抑制NLRP3的信号通路，为了证实这一猜想，作者构建了炎性体激活体外模型。

 3.2.2 炎性体激活体外模型构建

 作者通过脂多糖（LPS）和ATP刺激C2C12（小鼠成肌细胞），建立炎性体激活体外模型，发现敲降Rb1增强了细胞增殖（c），降低了NLRP3和Caspase-1的激活，并降低了IL-1β、IL-18这两种炎症因子的水平（d，e）。

3.3 Rb1通路的研究

通过以上实验，作者已经证实了Rb1的缺失会抑制NLRP3的信号通路，于是接下来，作者将通过STRING、cicrBank数据库以及一系列的验证实验对Rb1调控通路进行研究。

3.3.1 Rb1上游通路的研究

作者利用STRING数据库（string-db.org）鉴定出调控Rb1的上游信号分子，发现它与CDK6和转录因子E2F相互作用。以前的研究已表明miR-29b靶向CDK6，因此作者又研究了miR-29b是否调节CDK6/Rb1。

如下图所示，CDK6 mRNA的3’UTR有miR-29b的多个结合位点，而且双荧光素酶实验证实CDK6是miRNA-29b的靶点（b），我们联川云分析也可以在线预测miRNA和mRNA靶向关系和靶点（https://www.omicstudio.cn/analysis/targetGene）。此外，miR-29b模拟物抑制了C2C12细胞中CDK6蛋白的表达和Rb1蛋白的磷酸化（c）。 

  那么miRNA-29b又是如何被调控的呢？

目前ceRNA机制受到广泛关注，作者推测是否miRNA-29b也会被circRNA所调控，于是作者把目光转向circRNA，进行circRNA测序。

作者使用环状RNA （circRNA）测序来比较缺血肌肉和正常肌肉中circRNA的表达。在测得的circRNA中，cPWWP2A的表达最强，且在缺血条件下，它的表达量急剧下降，推测是否与我们的研究对象相关？

由于干细胞衍生的外泌体可以促进组织修复，作者将这些对照外泌体(NC-Exos)或沉默cPWWP2A表达的外泌体（si-Exos）注入缺血肌肉，以确定cPWWP2A是否参与介导源自人脐带衍生间充质干细胞（UMSC）的外泌体（UMSC-Exos）在肌肉中的有益作用。

结果表明，NC-Exos处理导致肌肉中cPWWP2A的表达增加，而si-Exos减弱了这种表达。与注射NC-Exos的小鼠相比，si-Exos处理导致血流恢复较慢 (g、h)，运动功能较差，肌肉力量和跑步距离减少，肌肉与体重比降低，NLRP3、Caspase-1表达较高(i)，血浆中IL-1β和IL-18水平增加(j)。

与转染NC-Exos的细胞相比，转染si-Exos的C2C12细胞中NLRP3和Caspase-1的表达量明显更高。因此，在si-Exos处理后，IL-1β和IL-18的水平增加了，并且细胞增殖受到抑制。

通过以上研究我们已经得知Rb1会影响NLRP3，而Rb1又与CDK6相互作用，CDK6又是miRNA-29b的靶基因，上述结果又表明cPWWP2A的缺失会影响NLRP3的表达，这些基因难道在一条路上？

果然，作者通过CircBank发现了cPWWP2A与miRNA-29b的结合位点，这与miRNA-29b和CDK6的结合位点一致。

并且经过双荧光素酶实验得到了证实，该实验显示miR-29b与cPWWP2A存在较强的结合。miR-29b在缺血肌肉中的表达增加了，这与cPWWP2A的表达相反（a）。这些结果表明，cPWWP2A是miR-29b的分子海绵。

证实了cPWWP2A与miR-29b的关系之后，接下来就要进一步探索cPWWP2A /miR-29b是否调控NLRP3信号通路了。

作者用miR-29b抑制剂处理C2C12细胞，结果表明，这降低了NLRP3和Caspase-1的表达以及IL-1β和IL-18的释放，但增强了C2C12细胞增殖，不过这些效应可被si-Exos逆转。

除了研究NLRP3和那两种炎症因子的变化之外，作者还研究了miR-29b的靶基因CDK6，结果表明，敲除C2C12细胞中的cPWWP2A导致CDK6 mRNA和蛋白的表达减少（miR-29b与cPWWP2A结合减少，导致它更容易作用到靶基因CDK6，于是CDK6 mRNA和蛋白的表达减少）。此外，C2C12细胞的分化被cPWWP2A siRNA抑制，但被miR-29b抑制剂激活。这些数据表明，cPWWP2A通过miR-29b/CDK6途径调节Rb1。

3.3.2 Rb1下游通路的研究

以前的研究已表明，Rb1的下调导致E2F转录因子的释放，进而激活AMP激酶α2（AMPKα2）的转录。而AMPKα2会抑制细胞中NLRP3的激活。那么，Rb1是否通过激活AMPKα2的转录来抑制NLRP3的激活呢？

结果表明，Rb1-mKO小鼠中AMPKα2 mRNA和蛋白的表达增加。AMPKα2沉默导致NLRP3和Caspase-1的表达增加，IL-1β和IL-18在细胞上清液中的释放增加，细胞增殖减少。

另外，在肌肉中注射AMPKα2 siRNA可增加肌肉中NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的mRNA表达，NLRP3和Caspase-1的蛋白表达，以及小鼠血浆中IL-1β和IL-18的水平。这些数据表明，Rb1的下调通过激活AMPKα2来抑制NLRP3的激活。

结论 CONCLUSIONS

Rb1调控NLRP3炎症体通路如图所示，Rb1的缺失会导致转录因子E2F的释放，这会激活AMPKα2的转录，进一步抑制NLRP3和细胞凋亡因子Caspase-1的表达，最后导致的结果就是炎症因子被抑制；并且作者还发现，外泌体可以通过释放cPWWP2A与miR-29b结合，使CDK6基因上调，从而抑制Rb1的表达，最后的结果，与将Rb1基因敲除这一做法一致， 这为治疗缺血性肌肉损伤的临床方案提供了新的策略。

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