木糖醇通过肠道微生物群的交叉喂养增强结肠中丙酸的合成 | 微生物专题

今天给大家分享的一篇文献来自浙江工商大学朱炫教授团队，2021年3月发表在Microbiome（IF 11.607）期刊上的文章，题目为 Xylitol enhances synthesis of propionate in the colon via cross-feeding of gut microbiota；该研究介绍了木糖醇在体内和体外影响肠道微生物群、代谢活动和有益代谢标志物的机制。根据微生物群落代谢组和转录组的结果，在分子水平上揭示了木糖醇对丙酸合成影响的机制。

研究背景

木糖醇是一种白色或透明的多元醇或糖醇，可被结肠微生物消化并促进有益细菌的增殖和短链脂肪酸(SCFA)的产生，但这些作用背后的机制尚不清楚。在之前的研究中发现，木糖醇增加了SCFAs（短链脂肪酸）的浓度，而SCFAs具有调节水和矿物质吸收、降低结肠pH值、抑制病原体、促进有益菌生长的能力。

研究表明，木糖醇和山梨糖可以显着促进丁酸的产生，这与Anaerostipes hadrus 和Anaerostipes caccae 的相对丰度增加有关；但进一步研究发现，Anaerostipes hadrus DSM 3319 体外纯培养不能利用木糖醇，表明肠道细菌之间存在交叉喂养系统。单一种类的细菌很少有完整的木糖醇消化基因。目前，木糖醇、肠道菌群和代谢活动之间相互作用的调控机制尚不清楚。

作者的研究结合了体内和体外两种实验方法，通过评估木糖醇的作用、其靶向点和方法来研究这种机制，探索木糖醇如何影响有益细菌和有害细菌的相对丰度。此外，进一步探索木糖醇在改变肠道微生物群组成后是否会改变代谢活动和途径以及肠道细菌之间如何存在交叉喂养关系，这可能与酶的翻译有关。根据微生物代谢途径，特别是SCFA途径，相关酶和关键细菌的转录，在单个细菌物种的背景下了解整个菌群的机制。

研究方法

采用体内、体外两种实验方法。在体内，通过0 %、2 %（2.17 g/kg/day）和5 %（5.42 g/kg/day）的木糖醇喂养小鼠3个月。除了小鼠体内消化实验外，还在体外将3%木糖醇（等同于人体摄入量0.27 g/kg/day）添加到结肠模拟系统（CDMN）中进行7天模拟酵解实验。通过16S rRNA测序、有益代谢生物标志物定量、代谢组和转录组分析，以研究木糖醇的益生元机制。选取与木糖醇消化相关的代表性细菌进行单培养和共培养，以探索木糖醇在含葡萄糖、木糖醇、混合碳源或无碳源培养基中的微生物消化利用机理。

研究结果

3.1 木糖醇处理小鼠肠道微生物组的变化

为了确定木糖醇如何影响小鼠结肠中的肠道微生物群，每月收集不同木糖醇处理下的小鼠粪便进行了16S rRNA测序。经过97%的相似度聚类分析，得到1521个OTU。在生态多样性评价中，α多样性可以反映一个群落内物种的丰度和多样性。使用Shannon指数评估群落的丰度和均匀度，发现木糖醇对结肠群落的均匀度和稳定性没有显着影响（图1 A）。并且通过主成分分析（PCA）来描述添加木糖醇后微生态的变化，在二维图PC1（33.4%）和PC2（30.1%）中，PCA结果表明，木糖醇导致肠道微生物组成的显著变化（图1 B）。

图1

接着作者分别从细菌门和属的层次上分别展示了群体的差异变化，ANOVA（T检验）方法用于计算木糖醇对改变肠道细菌门的影响；FDR法用于计算木糖醇对改变肠道细菌属的影响。结果表明，木糖醇降低了小鼠结肠中厚壁菌门的相对丰度，增加了放线菌门和拟杆菌门的相对丰度（图2）。而在属的层次中，木糖醇增加了双歧杆菌、乳杆菌和丹毒丝菌的相对丰度，并降低了布劳特氏菌和葡萄球菌的相对丰度。

图2

3.2 食用木糖醇后小鼠代谢组的变化

为了了解木糖醇对代谢的影响，引入代谢组学方法和SCFA分析来弄清楚它们之间的关系。结果显示用5%木糖醇处理最为显著，它使丙酸盐浓度增加到10.09 ± 0.05 mmol/g（比对照高4.6倍，见下表）。因此选择用5%木糖醇食物处理组的小鼠粪便和第三个月对照小鼠的粪便进行代谢分析。正离子模式下共检测有8310代谢离子，包括912上调，下调1152的离子（图3D）。在KEGG途径中对差异的代谢物进行了注释，作者发现木糖醇显着影响了17条代谢途径（Q<0.05），尤其是倍半萜和三萜生物合成途径以及萜类和聚酮化合物代谢的三级途径。在这些途径中，大多数涉及氨基酸代谢，如赖氨酸降解、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，以及酪氨酸代谢分析。

体内实验初步评估了木糖醇通过促进双歧杆菌和乳杆菌的生长对肠道微生物群和宿主的益生元作用。此外，木糖醇增加了有益代谢途径的产量，尤其是丙酸。代谢组学分析和SCFA分析均表明木糖醇主要影响氨基酸代谢并促进丙酸浓度。 

图3

3.3 木糖醇用量对生理指标的影响

作者通过称重小鼠的脑、胰腺、结肠和肝脏，并测量结肠长度。为了减少生物学差异，器官的重量比通过器官重量除以小鼠重量来计算。结果表明，在本研究期间，木糖醇补充剂对小鼠的生理机能没有显着影响（图4 E）。

图4

3.4 补充木糖醇的体外模拟系统中肠道微生物组的变化

为了确定在木糖醇消化过程中，人类肠道微生物群中是否存在交叉喂养系统，作者使用CDMN系统模拟研究了体外肠腔和粘膜中的细菌组成和代谢。在肠腔内（图5），提供木糖醇后，肠道微生物群中门的相对丰度发生了显着变化。我们可以看到，在升结肠（AC）中，木糖醇增加了厚壁菌门的相对丰度，同时降低了协同菌门和变形菌门的相对丰度。在横结肠（TC）中检测到厚壁菌门的相对丰度增加，拟杆菌门和变形菌门的相对丰度减少。在降结肠（DC）中，厚壁菌门的相对丰度增加，而变形菌门的相对丰度减少（p< 0.05)。总之，木糖醇增加了厚壁菌门的相对丰度，同时降低了肠腔中变形菌门的相对丰度，这与小鼠的结果相似。

在肠腔微生物群中最丰富的前20个属的结果如图5所示。主要细菌属于拟杆菌属、巨单胞菌属、普雷沃菌属、埃希氏菌属和肠球菌属。木糖醇刺激后AC和DC群落结构最不稳定，各属细菌相对丰度变化较大，说明木糖醇对这两个区域均有影响。补充木糖醇导致升结肠中大肠杆菌-志贺氏菌的相对丰度降低（Q< 0.05)和巨单胞菌属的增加(Q< 0.05)。横结肠微生物群落结构相对稳定。仅在第6天检测到布劳特氏菌属的相对丰度略有增加。在降结肠中观察到大肠杆菌-志贺氏菌、肠球菌和粪球菌的丰度降低（Q< 0.05）。总体而言，在CDMN中，木糖醇降低了大肠杆菌-志贺氏菌和肠球菌的比例。

图5

在粘膜中（图6），升结肠放线菌和厚壁菌门的相对丰度增加，而变形菌门的相对丰度减少，拟杆菌的丰度没有检测到显着变化。在横结肠中，厚壁菌门的比例增加，而放线菌和变形菌的比例减少，拟杆菌门的比例没有显着差异。在降结肠中检测到放线菌和厚壁菌门的相对丰度增加，拟杆菌门和变形菌门的相对丰度下降。木糖醇增加了毛螺菌科的比例并降低了每个肠道区域的大肠杆菌-志贺氏菌的比例，乳酸杆菌相对丰度的变化无显着差异。

图6

微生物群之间的Spearman相关性分析，对肠道菌群之间的关系和相互作用进行了测定，如示于图7E中存在三个重要的交互网络。酿酒酵母菌负调制拟杆菌属，柯林氏菌属，副拟杆菌属和厌氧菌属。乳杆菌对阿克曼芽孢杆菌、乳杆菌、类杆菌和梭状芽孢杆菌有负调控作用；而在不动杆菌、沙特氏菌和肠球菌之间存在正调控。虽然双歧杆菌没有加入这三个重要的相互作用网络中的任何一个，但它们之间有着密切的关系。双歧杆菌与酵母菌和不动杆菌三个细菌相互作用网络有关。此外，它还通过连接厌氧菌与毛梭菌网络相关。双歧杆菌与梭状芽胞杆菌和不动杆菌属的网络呈负相关。大肠杆菌-志贺氏菌与乳酸杆菌和拟杆菌呈正相关。并且不管大肠杆菌-志贺氏菌与其他细菌的相互作用模式如何，双歧杆菌总是能抑制它。此外，双歧杆菌与产生SCFA的细菌毛螺科和厌氧菌呈负相关。这些结果表明细菌的几个属通过交叉喂养系统参与了木糖醇代谢。

图7

3.5 体外模拟中木糖醇诱导的代谢组变化

通过SCFA 分析研究木糖醇与微生物群之间的关系。结果显示黏膜中SCFAs的浓度是管腔中的两倍,图8A。木糖醇显着增加了管腔和粘膜中SCFA的产量。然而，SCFA的类型和分布各不相同。木糖醇增加了结肠中丙酸盐和粘膜层中丁酸盐的浓度。在第6天，升结肠管腔中的丙酸盐水平增加了2.1倍，从13.6 ± 1.5mmol/L 增加到28.4 ± 2.1 mmol/L。在横结肠黏膜中，丁酸盐的产量从19.5 ± 3.4 mmol/L增加到 68.5 ± 4.5 mmol/L。与T=0时的数据相比，处理组管腔中丙酸盐浓度增加至43.1±2.3 mmol/L，横结肠粘膜中丁酸盐浓度增加至113.0±5.6 mmol/L。因此，肠道微生物群可以通过木糖醇合成丙酸，并且主要是由粘膜中的微生物群中产生的，以便快速利用。

典型相关分析（CCA）是一种综合描述两个变量之间相关性的统计分析。在这项研究中，肠道微生物群的相对丰度与SCFA浓度之间的相关性被用于CCA，这可以将SCFA的产生归因于物种。如图8B所示，丙酸盐和戊酸盐分布在第三象限，而乙酸和丁酸分别分布在第四象限。大多数微生物群位于第一、第二和第三象限。第二象限和第三象限中丙酸盐与几乎所有微生物之间的夹角是锐利的。这一结果表明，许多细菌，比如毛螺科菌，巨型单胞菌，梭状芽胞杆菌和乳酸杆菌参与了丙酸盐的生产。然而，只有有限的细菌有助于丁酸盐的产生。在粘膜层,短链脂肪酸分布在第四象限，和所述丁酸的生产在粘膜是最高的，这主要是涉及到的微生物在所述第一和第二象限，包括双歧杆菌，厌氧菌、萨特氏菌属、拟杆菌属和柠檬酸杆菌属以及大肠杆菌-志贺氏菌的相对丰度降低。有趣的是，在管腔或粘膜中，大肠杆菌-志贺氏菌和肠球菌与短链脂肪酸的产生无关，这与小鼠的结果一致。

图8

从肠道微生物群组成的结果来看，升结肠中的群落发生了重大变化，尤其是在开始的第一天和第二天。因此，选择这些样品的代谢组学特征进行分析。有8310个特征检测，包括161上调，下调145的功能（图9C）。总共有17条通路在添加木糖醇后表现出显着差异（Q< 0.05）。它们中的大多数被归类为氨基酸代谢和其他氨基酸代谢的二级途径（5个三级途径）和碳水化合物代谢（7个三级途径）。尽管在丙酸途径中没有观察到显着差异（Q= 0.0596)，我们发现甲基乙二醛、2-甲基-顺-乌头酸和2-甲基-反-乌头酸等代谢物富集。对于戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化（Q= 0.167），木糖醇转化的下游产品，如D-阿拉伯糖醇和核糖醇的生产得到增强。来自代谢组的木糖醇消化途径分析结果与宏转录组的结果一致。

图9

3.6 木糖醇对结肠微生物宏转录组的影响

与代谢组学分析一致，选择并收集相同的样本进行转录组分析。差异表达基因的火山图总共检测到12926种基因在本研究中显著差异，包括8930个上调基因（红色）和3996个下调基因（蓝色的）图10 D。经过基因测序、组装和注释后，基于木糖醇消化的酶在微生物群中的分布如图10E所示。添加木糖醇后，与木糖醇相关的酶量均增加。木糖醇脱氢酶（EC 1.1.1.14）、木酮糖激酶（EC 2.7.1.17）和木糖磷酸异构酶（EC 5.1.3.1）是木糖醇的基本消化酶，能够表达这些酶的微生物被认为是木糖醇消化的基础在细菌中。但是并非所有酶都存在于单个细菌中，例如，木糖醇脱氢酶（EC 1.1.1.14）主要分布在梭状芽胞杆菌、普罗维登斯菌属和毛螺菌属。其中，只有梭状芽胞杆菌具有木酮糖激酶 (EC 2.7.1.17)。在木酮糖磷酸异构酶分布的饼图中（EC 5.1.3.1），在毛螺菌属中没有发现该酶。我们猜测具有木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.14)的微生物将木糖醇转化为木糖，并将木糖转移到含有木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)的微生物中。代谢物通过木糖磷酸异构酶(EC 5.1.3.1)进一步转移到细菌中以逐步利用。这一结果进一步证明，与木糖醇消化相关的微生物群中存在交叉喂养系统。

图10

对差异表达基因功能的富集分析可以揭示微生物的功能。基于KEGG数据库进行显著通路富集分析的图11B。我们发现9个通路有显著差异（丙酸，嘌呤，碳水化合物代谢 p <0.05）。氨基酸合成是最丰富和显着变化的途径。结果表明，木糖醇消化不仅改变了肠道微生物群的组成，而且影响了其他营养物质的代谢途径。

木糖醇促进丙酸的产生，上调66个基因和下调31个基因，包括上调丁二酸途径中与丙酸合成相关的限制性酶的转录。从丙酰辅酶A到丙酸有2条途径。一种途径需要2个步骤进行磷酸化，而另一种途径需要一个步骤进行直接转化。磷酸乙酰转移酶(EC 2.3.1.8)是丙酸代谢的限制性酶，主要分布于双歧杆菌、类杆菌、大肠杆菌和肠球菌，图11C。在本研究中，该酶的数量增加了加了，图11A。

木糖醇诱导微生物中酶分布的变化。双歧杆菌和肠球菌中酶的比例分别从62%和3%增加到75%和8%，其他细菌中酶的比例下降，尤其是大肠杆菌和拟杆菌。因此，双歧杆菌和肠球菌是促进丙酸盐生成的潜在关键细菌。然而，从CCA的结果，我们知道肠球菌与SCFA的产生没有关系。故双歧杆菌对丙酸生产至关重要。丙酸辅酶A转移酶（EC 2.8.3.1）在一步途径中起作用，仅存在于黄曲霉菌中。在实验中摄入木糖醇后转录上调，

表明黄曲霉主要在丙酸辅酶A转移酶的帮助下将丙酰辅酶A转化为丙酸。我们的研究结果表明，来自不同细菌的木糖醇消化关键酶可以共同支持微生态的生长，但它们也提高了丙酸盐的浓度，从而降低了pH值，从而限制了拟杆菌和埃希氏菌的相对数量。基于这些细菌之间的交叉喂养和竞争，木糖醇可以动态平衡肠道微生物组的比例，以促进有益细菌和SCFA的相对丰度。

图11

3.7 木糖醇作为单株培养和共培养细菌的碳源

以葡萄糖和木糖醇为单一碳源或葡萄糖与木糖醇混合为单一碳源的碱性氮培养基，用于大肠杆菌、双歧杆菌、脆弱拟杆菌、罗伊氏乳杆菌的培养。结果表明木糖醇可以被双歧杆菌用作碳源。尽管脆弱拟杆菌在木糖醇培养基上存活，但它的生长不如在含有葡萄糖或没有碳源的培养基上生长得那么好。这意味着，木糖醇抑制脆弱拟杆菌的生长（图12D），罗伊氏乳杆菌在木糖醇培养基上生长有限。

细菌在共培养培养基中的生长如图12E所示,由于罗伊氏乳杆菌对培养基的酸化，大肠杆菌的生长在后期受到抑制;在木糖醇培养基上，我们发现在单株培养中不能使用木糖醇的罗伊氏乳杆菌生长良好，罗伊氏乳杆菌的数量远高于大肠杆菌的数量。三种生物共培养的生长情况与两种生物共培养的生长情况相似。在葡萄糖培养基上，罗伊氏乳杆菌还通过产酸抑制大肠杆菌的生长，但对脆弱拟杆菌没有影响。大肠杆菌的生长速度始终低于罗伊氏乳杆菌和脆弱拟杆菌。这表明罗伊氏乳杆菌和脆弱拟杆菌是优势菌，而木糖醇对群落结构没有影响。

图12

总结

作者通过给小鼠喂食木糖醇来研究木糖醇对小鼠肠道微生物群和代谢活动的影响。利用体外结肠模拟系统，研究了木糖醇对升结肠、横结肠和降结肠微生物动态变化的影响及其对SCFAs产生的影响。选择关键菌进行二、三菌的单培养和共培养，考察微生物利用木糖醇的途径。在分子水平上研究木糖醇对微生物调控的作用。其机理可以总结如下：木糖醇维持双歧杆菌、拟杆菌属、乳杆菌属和毛螺科菌属的相对量体内，并从这些细菌中促进与木糖醇相关的酶。此外，它增加了管腔中的所有SCFA，尤其是丙酸盐和粘膜中的丁酸盐，同时在体外肠道中相应的细菌发生了变化。在木糖醇的利用中，罗伊氏乳杆菌、脆弱拟杆菌和大肠杆菌之间存在交叉饲养关系。在分子水平上，揭示了微生物组中的交叉喂养关系。木糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.14)、木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)和木酮糖磷酸异构酶(EC 5.1.3.1)是木糖醇代谢的关键酶，存在于拟杆菌和毛螺菌科。因此，它们被认为是木糖醇消化中的基本细菌。此外，木糖醇还影响丙酸的代谢途径，显着促进双歧杆菌中丙酸限速酶磷酸乙酰转移酶（EC 2.3.1.8）的转录水平。只有来自不同细菌的酶共同作用才能支持微生态的能量代谢和生长，但另一方面，它们也增加了丙酸盐的含量，从而降低了pH值，从而限制了埃希氏菌的生长。通过这些细胞之间的交叉喂养和竞争，木糖醇可以动态平衡肠道微生物组的相对数量，以促进宿主的健康。

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